Vero细胞培养H7N9流感病毒及其纯化工艺研究
流感在全球范围内每年都有流行和暴发，严重威胁人类健康。自2013年以来，我国共计发生五次H7N9人群感染暴发疫情，截至2019年4月，H7N9感染病例1642例，其中612人死亡，病死率高达39％。最经济有效的预防控制措施就是接种流感疫苗。但目前国内的流感疫苗是基于鸡胚生产获得，鸡胚流感疫苗存在供应周期长、会引起过敏等缺点，世界卫生组织推荐使用Vero细胞作为生产流感疫苗的替代基质。 本研究所用毒株是实验室前期利用反向遗传学技术重配得到的流感病毒Vero细胞适应株A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va，我们进一步对其在Vero细胞上的培养条件进行优化，提高了病毒在Vero细胞上的产量，血凝滴度可达1∶512，感染性滴度达8.5LgTCID50/ml，并在传代20代后维持稳定，以此建立了毒种工作库，并对细胞工厂大规模培养流感病毒的生产工艺进行优化，病毒收获液血凝滴度稳定在1∶1024，实现了规模化生产。 将H7N9Va病毒液收获液依次进行过滤澄清、甲醛灭活、300KD超滤浓缩后，用强阴离子交换Unigel-30Q和复合模式层析Captocore700两级层析纯化，并进行条件优化，Unigel-30Q层析时的盐离子浓度为0.5MNaCl+20mMPB，pH6.8-7.4，Captocore700层析时盐离子浓度为0.15MNaCl+20mMPB，pH7.4。其中强阴离子交换Unigel-30Q对残余DNA去除率可达到90％以上，整个纯化过程避免了病毒捕获步骤，极大降低了病毒损失率，可快速而高效地纯化病毒液，病毒回收率达58.4％，最终血凝素含量132.12μg/ml，Vero细胞残余DNA去除率可达99.95％，最终含量为28.69pg/剂，杂蛋白去除率可达98.87％，最终Vero细胞宿主蛋白含量为28.28ng/剂，牛血清白蛋白含量为11.36ng/剂，均达到WHO和《中国药典》标准。 综上所述，本研究确定了流感病毒A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va在Vero细胞中培养的适宜条件，建立了毒种工作库。实现了流感病毒H7N9Va的Vero细胞大规模培养，得到了细胞流感全病毒灭活疫苗快速而高效的纯化工艺，对将来应对大流行流感暴发的应急储备具有重要意义。
Vero细胞;细胞培养;H7N9流感病毒;纯化工艺;流感疫苗
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
生物制品学
李卫东
2019
中文
TQ464;R392
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）