对编码抑制细胞凋亡分子的HSV--1 us3基因的修饰突变可促进病毒在小鼠模型上的减毒表型
人类单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus 1，HSV-1)是一个具有复杂的基因结构和转录调控机制的双链DNA病毒，可引起口唇疱疹甚至神经系统感染等疾病，并潜伏于神经组织中。目前HSV-1在全球不同人群中的感染率极高，而治疗药物较为单一，并且尚未开发有效的疫苗预防其感染。因此，减毒活疫苗是有效预防控制HSV-1感染的选择之一，而基因突变减毒株的研究在HSV-1减毒活疫苗的研发中具有重要的提示意义。 络氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因us3是HSV-1基因组中的重要基因，对细胞凋亡具有调节作用。我们实验室前期基于对HSV-1编码蛋白的综合探索，制备了具有明确减毒表型的M3减毒株，现在M3的基础上利用CRISPR/Cas9系统构建us3基因缺失突变株M4。但对M4的生物学特性和减毒表型尚不清楚，所以我们在BALB/c小鼠模型上进行初步探索。首先我们在KMB17细胞上做了M4与M3的增殖能力比较，M4与M3保持了较为一致的低增殖能力，提示us3基因的缺失并不会影响M4的体外增殖。同时对于缺失us3基因的M4是否还具有抗宿主细胞凋亡功能，我们进行体外流式细胞和形态学检测，结果表明M4较野生型毒株McKrae和M3可诱导明确的细胞凋亡，可能是us3功能抑制导致的。在进一步的动物实验中，我们以1×104CCID50剂量对小鼠进行McKrae野毒株、M3和M4突变株的感染，观察感染小鼠急性期的临床症状，结果显示M4减毒株组无明显临床表现，体重稳定增加，生存状态良好。对神经组织脑、脊髓的病理学检测结果表明，野毒组小鼠均出现出血等病理损伤，而M3、M4组小鼠未有病理损伤;对M4组小鼠重要器官中病毒增殖检测表明，M4组病毒载量显著低于McKrae组，略低于M3组，提示了us3基因的缺失保持了M3减毒性状。此外，对部分与炎性损伤相关信号的表达水平检测，发现M4感染组小鼠多个组织中炎性因子表达水平与McKrae、M3感染组小鼠组织相比显著下降，可能是us3基因功能性抑制下调机体炎症反应;对三株毒株在小鼠体内诱导的免疫反应及临床保护率进行分析表明，我们发现M4较M3能诱导更强的中和抗体水平和细胞免疫反应，针对McKrae的攻击M4感染组小鼠重要组织中病毒载量低于M3组小鼠组织，可能是us3基因的突变提高了机体的免疫保护，该免疫保护促进对病毒的有效清除及控制;以上实验结果提示编码抑制细胞凋亡分子的HSV-1us3基因的修饰突变株M4在小鼠模型上表现了较M3更为明显的减毒表型。 该工作的结果为HSV减毒机制的深入研究提供了基础，对开发Ⅰ型单纯疱疹病毒的减毒活疫苗具有一定的临床转化意义。
人类单纯疱疹病毒Ⅰ型;细胞凋亡;us3基因;调控机制
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
生物制品学
李琦涵
2019
中文
R392
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）