循环肿瘤干细胞类器官培养技术以及单细胞分离标记技术的建立
循环肿瘤干细胞在外周血中的数量极少，但却在肿瘤的复发和转移中起着关键作用。因此，获取外周血中循环肿瘤干细胞的信息，对于临床早期控制肿瘤复发和转移具有重要的临床意义。然而，循环肿瘤细胞的捕获、富集和培养扩增是一个技术难点，本研究旨在建立一种循环肿瘤干细胞的3D类器官培养技术，以及基于微流控液滴的单细胞分离和标记技术。 在本研究中，我们首先利用模拟肿瘤患者样本，通过阴性筛选的方法富集血液中加入的肿瘤细胞，随后采用无血清条件培养基将富集得到的细胞进行3D培养。在光镜下，我们观察到在富集获得的细胞中有极少数细胞能够培养形成细胞微球。进一步免疫荧光染色结果显示，在3D培养条件下成团生长的细胞不仅表达上皮细胞来源的标志EpCAM，还表达肿瘤干细胞的标志CD133。然后，我们通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法，分别比较了前列腺癌LNCaP细胞和肺癌H2347细胞在3D培养体系中与普通2D培养的条件下干性相关基因的表达水平。结果表明:3D培养获得的肿瘤细胞与普通2D培养相比，干性相关基因如CD133、CD44和ABCG2的表达水平显著升高。前列腺癌LNCaP细胞在无血清3D培养7天后，计数直径超过70μm的单克隆微球的数量，确定前列腺癌LNCaP细胞系成球率为(18.67±3.06)％。在普通2D培养体系下，利用化疗药顺铂处理前列腺癌Tsu-Prl细胞，筛选获得耐药的肿瘤干细胞，然后再种植于3D培养体系中，发现这部分肿瘤细胞表现出更强的细胞增殖能力，可以形成直径更大的肿瘤细胞微球。 随后，我们使用肺癌患者肺叶切除术中的肺静脉血4mL，通过上述同样的方法进行3D类器官培养，成功培养获得肺癌的肿瘤细胞微球。在光镜下观察同一位肿瘤患者不同的肿瘤细胞微球呈现不同的形态特征，表明这种类器官培养技术能够展示循环肿瘤细胞的异质性。而且有的肿瘤细胞微球中间形成囊腔，形成类器官样形态，我们称这些肿瘤细胞微球为肺癌类器官。目前，我们一共收集了6例肺癌患者的样本，其中有3例成功地培养形成肺癌类器官，并在体外长期培养超过1个月，长期培养成功率为50％。之后，我们将培养获得的样本进行固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色分析肺癌类器官的形态结构特征。苏木精-伊红染色结果显示，培养获得的肺癌类器官呈现明显的细胞形态和细胞核的异形性，表现出典型的癌细胞的特征，同时具有一定的细胞连接和组织结构的特点。 另一方面，为了深入研究不同肿瘤细胞的分子表型特征，我们基于“Drop-seq”原理，自主搭建高通量的液滴微流控单细胞转录组检测平台。通过搭建的微流控体系，我们成功实现单个细胞和单个标记微球在油包水型微滴中的共同包裹，即完成单细胞的分离与标记。在油相和水相流速分别为200μL/min和30μL/min的条件下，细胞和微球浓度分别为250个/μL和400个/μL时，达到最适细胞标记率为(11.87±3.75)％。为了评价建立的微流控单细胞转录组检测技术的可靠性，我们以混合的人急性早幼粒白血病细胞系HL-60和小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10作为模拟样品进行单细胞标记和测序，共获得7535个细胞的转录组数据。其中，人和鼠转录本混合的细胞有70个，仅占全部细胞的0.9％，表明我们建立的微流控单细胞转录组检测技术所获得的单细胞转录组数据具有较高的准确性。随后，通过深入分析单细胞转录组的数据，我们不仅能够区分两类细胞，还能够筛选出每类细胞的特异性表达标志物。 综上所述，本研究建立了一种循环肿瘤细胞的3D类器官培养体系，能够富集循环肿瘤干细胞，并利用该方法成功培养获得肺癌类器官，不仅能够展现循环肿瘤细胞的异质性，而且还表现出一定的组织结构特征。此外，本研究还成功建立了一个基于微流控液滴的单细胞转录组检测平台，该平台的各项指标能够满足肿瘤学实验室的要求，在肿瘤研究中具有广泛的潜在应用价值。
循环肿瘤干细胞;3D类器官培养;微流控液滴;单细胞分离;分子标记
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
肿瘤学（基础）
张开泰
2019
中文
R73-3
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）