M1和M2型巨噬细胞对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的不同影响的研究
研究背景: 脂肪移植是整形外科中修复软组织缺损的重要治疗手段，但移植后出现的囊肿、结节等并发症和较低的体积保持率等问题都与脂肪坏死有关。脂肪移植后的脂肪细胞再生既是以往研究中观察到的现象，也是解决脂肪坏死问题的重要途径。脂肪组织中，成熟脂肪细胞再生的主要来源为PDGFRα+前体脂肪细胞，但PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂分化如何被调控仍不十分清楚。脂肪移植后的炎症微环境对脂肪再生有着重要影响，而巨噬细胞在炎症反应中扮演关键角色。巨噬细胞的不同亚型即M1和M2巨噬细胞，对PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂分化调控可能存在不同的作用。 研究目的: 本研究分别设计了巨噬细胞上清液与前体脂肪细胞共培养实验、小鼠自体脂肪移植巨噬细胞清除实验，并检测细胞或组织的成脂效果和成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的表达，探讨炎症微环境中M1/M2型巨噬细胞对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的影响，明确M1和M2型巨噬细胞分别对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的促进或抑制作用。本研究主要从如下几方面进行: 1.探讨M1和M2型巨噬细胞分泌炎性因子和发挥作用的差别。 2.探讨脂肪移植后，脂肪组织内M1和M2型巨噬细胞出现时机和数量变化趋势。 3.明确M1和M2型巨噬细胞对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的影响，作用是促进还是抑制。 研究方法: 体外实验 1.体外分离培养小鼠原代骨髓细胞，体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激骨髓细胞分化为巨噬细胞，并分别用γ干扰素(IFN-γ)、脂多糖(LPS)和白细胞介素4(IL-4)刺激巨噬细胞极化为M1和M2型巨噬细胞，收集M1和M2型巨噬细胞上清液并用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其中炎症因子含量。 2.体外分离培养小鼠原代脂肪干细胞，从中分选PDGFRα+前体脂肪细胞，并分别于静息状态(非成脂诱导)和激活状态(成脂诱导)下培养扩增，培养同时分别加入M1型或M2型巨噬细胞上清液进行共培养。 3.用油红O染色共培养后的PDGFRα+前体脂肪细胞，进行成脂效果的定性分析;用Real-timePCR检测共培养后PDGFRα+前体脂肪细胞的PPARγ和C/EBPα基因表达，用Westernblot检测共培养后PDGFRα+前体脂肪细胞的PPARγ和C/EBPα蛋白表达，定量分析PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂效果。 体内实验 1.对小鼠行自体脂肪移植术，将小鼠的腹股沟脂肪移植于同一只小鼠的背部。 2.分别于术后第0、4、11、13、16、25、30天取材，进行流式细胞检测移植物中M1和M2巨噬细胞占总细胞含量比例并绘制随时间含量变化曲线。 3.再次对小鼠行自体脂肪移植术，于部分小鼠背部脂肪移植物内注射氯化钆(GdCl3)，选择性清除移植物内的M1巨噬细胞;于部分小鼠背部脂肪移植物内注射氯膦酸二钠脂质体(m-Clodrosome(R))，选择性清除移植物内M2巨噬细胞;两组实验均设置相应的对照组。移植物内药物注射每周2次，持续8周后取材。 4.对脂肪组织标本进行围脂滴蛋白(Perilipin)免疫组化染色，定性评价成脂效果;用Real-timePCR检测脂肪组织的PPARγ和C/EBPα基因表达，用Westernblot检测脂肪组织的PPARγ和C/EBPα蛋白表达，定量分析移植物成脂效果。 研究结果: 体外实验 1.M1型和M2型巨噬细胞上清液所含炎性因子含量有较大差别，M1型巨噬细胞上清液中促炎因子(TNF-α、iNOS、IL-12)含量明显高于M2型巨噬细胞，而M2型巨噬细胞上清液中抗炎及促生长因子(IL-10、TGF-β1)含量明显高于M1型巨噬细胞。 2.PDGFRα+前体脂肪细胞静息状态下(无成脂诱导)巨噬细胞对其成脂分化无明显影响，而在活化状态下(成脂诱导)M1型巨噬细胞能明显抑制PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化，M2型巨噬细胞未表现出抑制或促进作用。 体内实验 1.小鼠自体脂肪移植后移植物内M1型巨噬细胞早期含量上升后期下降，M2型巨噬细胞早期维持在较低水平，后期含量逐渐上升。 2.选择性清除脂肪移植物内M1型巨噬细胞后，移植物成脂明显增加，而选择性清除移植物内M2型巨噬细胞后移植物的成脂没有发生明显变化。 研究结论: 1.M1型和M2型巨噬细胞主要分泌不同炎症因子，发挥了不同的功能，M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，而M2型巨噬细胞主要分泌抗炎及促生长因子。 2.脂肪移植后巨噬细胞的浸润早期以M1型巨噬细胞为主，后期以M2型巨噬细胞为主。 3.巨噬细胞可以直接影响前体脂肪细胞的成脂分化，并且M1/M2型巨噬细胞发挥了不同作用:M1型巨噬细胞可以显著抑制脂肪组织内前体脂肪细胞的成脂分化，M2型巨噬细胞对前体脂肪细胞成脂分化无明显影响。
前体脂肪细胞;巨噬细胞;成脂分化;脂肪再生
中国医学科学院北京协和医学院
博士
外科学（整形外科）
栾杰
2019
中文
R622
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）