荒漠肉苁蓉缓解体力疲劳的有效组分及作用机制研究
本课题组前期应用“谱-效”关系对肉苁蓉的化学成分及体外清除1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)抗氧化能力和抗疲劳药效进行研究，得到两个有效组分分别为总苷类和多糖类成分，但两者的药效作用存在差异，而且这两类成分在本课题组较早的研究及相关文献报道中均发现其口服吸收不良、肠道吸收利用度差，因此，其抗疲劳药效物质基础及作用机制还需要进一步探讨研究。 本论文通过化学成分定性、定量表征方法，结合药理学的药物代谢和药效学实验及代谢组学、高通量肠道菌群测序技术的应用，对肉苁蓉缓解体力疲劳作用物质基础及作用机制进行了系统研究，研究其缓解体力疲劳作用的物质基础及作用机制，并获得了这些成分在调节体力疲劳中的异常生物标志物及相关代谢通路紊乱方面的贡献，以及对体力疲劳异常肠道菌群的正向调控作用，诠释了肉苁蓉抗疲劳的有效组分及药效作用，为其进一步临床应用、开发方面提供了科学依据。 1.肉苁蓉提取物化学成分及体内代谢研究 采用UHPLC-Q/TOFHRMS技术对肉苁蓉70％乙醇提取物进行化学成分的在线快速鉴定，共鉴定44个化合物;首次综合高效凝胶色谱-多角度激光散射联用仪、离子色谱仪及高分辨液质联用仪，对肉苁蓉多糖的分子量分布情况、单糖组成、部分酸水解成寡糖片段后的聚合度和序列结构进行定性分析，建立起其所含大分子多糖成分的表征体系，为后续开展肉苁蓉药材质量评价、药效作用机制的研究奠定了基础。 进一步对肉苁蓉70％乙醇提取物在体内的代谢情况进行分析，基于UPLC-Q/TOF/MS和质量亏损过滤(MDF)策略鉴定代谢物，在大鼠血浆、尿液、粪便中共鉴定出20个原形类成分，32个代谢物，血浆中包括13个入血原形类成分及16个代谢物，尿液中包括18个原形类成分及24个代谢物，粪便当中包括17个原形类成分及17个代谢物，表明其在体内经历了广泛地代谢，其代谢类型以水解、甲基化、磺酸化以及葡萄糖醛酸化等形式存在。体内代谢特征分析发现，粪便中检测到了大部分的苯乙醇苷类的原形类化合物以及包括母体化合物和水解产物在内的还原、甲基化及磺酸化等代谢产物，这一结果进一步证实了苯乙醇苷类化合物口服吸收利用度低，与被肠道菌群代谢造成其低的肠道生物利用度有关。肉从蓉中的主要成分苯乙醇苷类化合物在体内代谢活化后共同起效，次要成分环烯醚萜苷类化合物也是被代谢成苷元后吸收入血，初步阐明了肉苁蓉的体内代谢情况，为筛选其药效物质及临床作用机制研究提供了依据。 基于UHPLC-Q-ExactiveOrbitrapHRMS和体外肠道菌群培养方法，进一步分别研究肉苁蓉中4个代表性苯乙醇苷化合物的体外菌群代谢情况，发现此类化合物极易发生糖苷键及酯键水解代谢，最终水解成其苷元羟基酪醇和咖啡酸。生成的降解代谢物会继续发生Ⅰ相、Ⅱ相代谢反应生成新代谢物，代谢位点主要在酚羟基结构单元上。证实了肠道菌群在苯乙醇苷类化合物代谢过程中的作用。此外，采用体外DPPH抗氧化实验对9个原形苷类化合物及代谢后生成的12个特征代谢物进行活性评价，进一步明确发挥抗氧化活性的结构与邻二酚羟基结构有关。体内、体外代谢研究结果都表明其主要化学成分苯乙醇苷类化合物可被肠道菌群代谢，产生了与原形成分相似活性的代谢产物苷元羟基酪醇和咖啡酸等酚酸类似物，吸收入血后协同发挥相应的药理效应。 此外，应用UPLC-Q/Trap-MS/MS技术的多反应检测(MRM)模式，采用内标法建立了肉苁蓉中10个化合物含量的同时测定方法，结果表明在优化的实验条件下，方法学考察结果均符合药典要求，表明建立的定量方法灵敏、快速、可靠，结合多糖成分的含量测定，可更全面的用于肉苁蓉药材质量标准研究。 2.肉苁蓉缓解体力疲劳、抗氧化作用的药效学及代谢组学研究 采用多种药效学评价指标和基于UHPLC-Q-ExactiveOrbitrapHRMS的代谢组学技术对长期负重游泳导致体力疲劳模型的小鼠以及分别给予总苷、多糖以及总苷-多糖联合用药的药物治疗组进行血清代谢组学研究，分别采用不同的前处理方法、色谱-质谱条件对不同极性的内源性代谢物进行较为全面的综合分析，共鉴定27个与体力疲劳疾病最为相关的潜在生物标志物，主要涉及体内氨基酸代谢、脂质代谢及嘌呤、嘧啶核苷酸代谢途径紊乱，经研究总苷、多糖及两者合用用药治疗对机体疲劳的代谢组学产生的影响时发现，机体代谢轮廓上治疗后不同程度的偏离模型组趋于正常组，联合用药可回调的代谢物最多，其次为总苷和多糖组分，改善其相关代谢途径的紊乱，并结合抗疲劳相关的药效指标对肉苁蓉抗疲劳的有效组分及作用机制研究提供了依据。 3.体力疲劳小鼠的肠道菌群紊乱及总有效组分的调控研究 应用16SrRNA基因测序法对体力疲劳模型小鼠的肠道菌群物种组成进行了分析。结果发现，体力疲劳小鼠中的肠道微生物多样性及门和属水平的结构组成均出现差异，表明这些肠道菌群可能在体力疲劳疾病中发挥着非常重要的作用，进一步研究了总有效组分对体力疲劳诱导的小鼠肠道菌群紊乱的影响。结果显示，对厚壁菌门和拟杆菌门及绝大部分相关菌属紊乱有明显的调节作用，表明肉苁蓉总有效组分可对体力疲劳小鼠的肠道菌群紊乱进行调控，从而发挥药效作用，但是仅限于菌群测序的初步研究结果还需要结合其它方法进一步深入验证。 综上所述，本论文应用UHPLC-Q-ExactiveOrbitrapHRMS技术的非靶向代谢组学和肠道菌群研究，结合药效学、体内、外代谢及代谢组、肠道菌群调控，多层次、多角度地阐释了各有效成分的作用机制。特别是这些口服后低生物利用度、吸收不良但是具有显著活性的成分可能是通过肠道菌群的转化被活化发挥药效，还能够作用于菌群，调节肠道微生态环境，达到对机体产生调节的作用。
荒漠肉苁蓉;有效组分;体力疲劳;代谢组学
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生药学（学术型）
石钺
2019
中文
R285.5;R284.1
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）