全基因分析揭示H3N2流感病毒临床分离株的低血凝滴度与NS基因截短相关
甲型流感病毒(InfluenzaA viruses，IAV)是正粘病毒科的一员，为单股负链分节段的RNA病毒，可引起具有高度传染性的急性呼吸道疾病。它是每年季节性流感的主要病原体，也是全球儿童急性呼吸道感染的重要病毒性病原。IAV根据其表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuramidinase，NA)的抗原性差异分为多个亚型。目前，感染人的甲型流感病毒主要有H1N1和H3N2两个亚型。为了更好的了解、预防和控制流感病毒，世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)在全球范围对流感病毒进行监测，即持续、系统地对流感样病例进行标本采集和病毒分离，并分析其基因特征和流行特征。流感疫苗是预防流感病毒感染及感染导致的相关严重并发症的最有效手段。WHO利用全球各流感监测网络实验室提交的流感病毒分离株进行下一流感季流感疫苗成分的推荐。但近年甲型H3N2流感病毒疫苗成分有效性低及其在临床标本分离过程中血凝滴度降低的情况引起了研究者的关注。甲型H3N2流感病毒的低血凝滴度临床标本分离株不能参与流感疫苗推荐株的筛选，因此会影响到疫苗推荐株的匹配性从而进一步影响了H3N2流感病毒疫苗的有效性。 目的:从基因水平探索近年H3N2流感病毒临床分离株中血凝滴度低的原因并分析H3N2流感病毒分离株的基因多样性。 方法:统计2012年9月～2017年8月五个连续流感季由本实验室将临床标本接种MDCK细胞分离得到的H3N2流感病毒第1代分离株的血凝滴度。在五个流感季中选取40株血凝滴度≤8的低滴度毒株，并匹配相近时间段分离到的31株血凝滴度≥32的高滴度毒株，经MDCK细胞连续传代3次后再次确认血凝滴度。提取传代毒株核酸，RT-PCR分段扩增病毒全基因并测序。测序结果亦根据传代后血凝滴度分为高、低血凝滴度两组毒株，利用MEGAv7.0建立ML系统发育树，观察两组毒株在进化树行上的分布规律;使用Datamonkey和NetNGlyc1.0Server在线软件进行分析，比较两组毒株的基因特征。将存在基因异常的毒株与对应基因组正常的毒株进行多次传代，观察两者的致MDCK细胞病变情况，进行毒力滴定，空斑纯化并绘制增殖曲线。同时，对全部测序毒株的基因多样性进行分析，使用RDPv4软件进行重组检测，通过DAMBE软件进行饱和度检测，应用MEGAv7.0计算最佳核苷酸替代模型，通过TempEstv1.5.1检测进化树的时间信号。采用贝叶斯马尔科夫蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法分析各基因片段系统进化及种群动态。Datamonkey在线软件使用不同算法进行各基因片段选择压力位点预测，NetNGlyc1.0Server在线软件进行N-糖基化位点的预测。 结果: 1.本研究室于2012～2017五个连续流感季，自临床标本中共分离到566株H3N2流感病毒，其中168株血凝滴度≤4，占29.68％(168/566);在2014～2015流感季分离到的血凝滴度≤4的毒株比例最高，为43.1％(69/160)。 2.选取的71株分离毒株经3次传代后，原31株高血凝滴度毒株的血凝滴度均维持在32以上;而原40株低血凝滴度毒株中，15株有不同程度血凝滴度升高，其余25株血凝滴度仍保持在≤8的水平。 3.在系统发育树上的分布、正向选择压力位点及HA和NA蛋白上的潜在N-糖基化位点的数目和位置，高血凝滴度与低血凝滴毒株之间无差异。 4.在25株滴度≤8的毒株中，有20株在全基因扩增时出现了额外截短的NS基因扩增产物。含额外截短NS基因的毒株在12h、24h、36h和48h各时间点收获的病毒培养上清中其病毒毒粒数量分别为4.8×103、3.2×105、4.5×105和3.7×105p.f.u.ml-1，显著低于不含截短NS基因毒株各时间点收获的病毒培养上清中病毒毒粒数量，1.3×104、1.2×106、4.0×106和2.3×106p.f.u.ml-1。 5.构建全基因编码序列及各基因片段ML系统发育树均表现为典型的以单一主干发展且侧枝很短的梯形树;2014-2015流感季的测序毒株均分为两簇，即CladeⅠ与CladeⅡ，CladeⅡ由基因片段重配形成并发生了该流感季的第二次抗原漂移。 6.贝叶斯MCMC动态分析各基因片段的进化特征，结果显示2013年11月前后，各基因片段的有效群体大小(EPS)均急剧扩张; 7.选择压力位点检测:在HA基因上共检测到6个正向选择压力位点，NA基因上检测到3个正向选择压力位点，PA基因上仅检测到1个正向选择压力位点;且3个蛋白上的4个正向选择压力位点为本研究中检测到的病毒进化过程中的协同进化位点。 8.糖基化位点的检测:HA蛋白上第144位潜在糖基化位点消失而第158位潜在糖基化位点出现，126位糖基化位点的存在与否可能与2012～2013流感季和2014～2015流感季CladeⅡ分支两次抗漂移密切相关。 结论:除了额外截短的NS基因，在H3N2流感病毒的各基因片段中未发现与血凝滴度高低相关的一致的基因改变;H3N2临床标本分离株在MDCK细胞传代过程中出现的额外截短NS基因可能是近年部分H3N2流感病毒分离株血凝滴度低的原因;含有截短的NS基因的病毒毒粒可能无法在空斑实验中由单个缺陷病毒颗粒形成空斑，NS基因的截短影响了毒株的增殖而表现为低血凝滴度。H3N2流感病毒的亚型内基因片段重配较常见，且多涉及病毒进化中抗原性的改变;H3N2流感病毒进化过程中在同一基因片段内或不同基因片段间可存在协同进化的情况;有效种群大小(EPS)的急剧扩张提示重配的发生和病毒抗原的漂移;在流感病毒分离传代过程中应重视血凝滴度低的毒株，其可能提示毒株的抗原改变和基因异常。
流感病毒;临床分离;低血凝滴度;基因分析
中国医学科学院北京协和医学院
博士
儿科学
钱渊
2018
中文
R725.1
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）