寨卡病毒抑制内皮转运体Mfsd2a及其致病机制研究
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为黄病毒科中新兴的虫媒病毒，主要通过蚊虫叮咬传播给人类。和大多数黄病毒科成员不同的是，ZIKV可通过性行为、输血或者体液接触等多种途径在人与人之间传播。在近期的流行中，ZIKV感染引起的新生儿小头症数量急剧增加，受到了全球的广泛关注。ZIKV感染怀孕的女性后，可将病毒垂直传播给下一代，感染所致的胎儿及新生儿小头症对人类的健康造成了巨大的威胁。有研究显示，ZIKV能够直接感染并穿过血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)，并改变小鼠大脑脉管系统的完整性，导致BBB的渗漏、神经前体细胞(Neural precursor cells，NPCs)细胞周期阻滞和凋亡以及大量神经元死亡。 组成BBB的大脑微血管内皮细胞表面表达多种特异性的转运体，负责将循环系统中的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和糖类等营养物质转运入脑。DHA为大脑发育和维持大脑正常功能所必需的，由于大脑本身不能合成DHA，血液中的DHA主要以LPC-DHA的形式利用大脑内皮细胞上特异性转运体Mfsd2a转运入脑。Mfsd2a作为DHA的转运体，在BBB的形成和功能维持以及大脑发育过程至关重要。在人体中，Mfsd2a基因发生功能缺失性突变后出现致死性小头症。 尽管目前针对于ZIKV的研究取得了很大进展，但是ZIKV的致病机制尚未完全阐明，尤其在感染后BBB中大脑血管微环境的改变方面鲜有报道。ZIKV感染对血脑屏障脉管系统中Mfsd2a的表达和功能的影响尚不清楚。鉴于Mfsd2a缺失与小头症的关联性，本研究系统分析了ZIKV感染对Mfsd2a的调节作用，并进行了深入的功能分析。 为了研究ZIKV感染对Mfsd2a表达的影响，本课题利用体外培养的人原代微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells，hBMECs)以及出生后第0天的BALB/C新生鼠建立体内外ZIKV感染模型。利用上述ZIKV感染模型发现，ZIKV感染显著下调Mfsd2a的蛋白水平，但对Mfsd2a的mRNA水平无明显影响;在ZIKV的结构蛋白和非结构蛋白之中，只有包膜(Envelope，E)蛋白具有下调Mfsd2a蛋白水平的功能;利用多种蛋白降解通路相关抑制剂进行筛选发现，蛋白酶体抑制剂MG-132能够逆转ZIKVE导致的Mfsd2a蛋白降解;此外，通过Co-IP实验进一步研究发现，ZIKVE蛋白能够同Mfsd2a蛋白直接相互作用，并使Mfsd2a发生多聚泛素化;Mfsd2a蛋白中的第3，46，296和436位的赖氨酸为参与其降解的关键位点，这些位点中任意一个发生突变均能抑制ZIKVE对Mfsd2a的降解;当在小鼠体内过表达ZIKVE蛋白后，也能够导致轻微的小头症表型。这些结果说明，ZIKV通过其结构蛋白E特异性降解微血管内皮细胞中的Mfsd2a蛋白，这种降解作用依赖于泛素-蛋白酶体途径。ZIKVE对Mfsd2a的降解功能可能为ZIKV损伤胎儿大脑发育和导致新生儿小头症的重要原因之一。 由于Mfsd2a在LPC-DHA及LPC-其他脂肪酸的转运上具有至关重要的功能，为了深入研究ZIKV感染对细胞的脂质吸收功能的影响，我们利用LPC荧光衍生物TopFluorLPC进行细胞脂质吸收实验，发现ZIKV感染显著抑制了体外培养的hBMEC细胞以及稳定表达Mfsd2a的A549细胞对TopFluorLPC的吸收;此外，利用质谱技术分析细胞中的脂质组分，发现ZIKV感染后hBMEC细胞和小鼠脑组织中总DHA含量以及多种含有DHA的磷脂含量均显著降低;感染早期补充DHA或者OA后，新生鼠无论在体重、脑重还是大脑尺寸上都有所增加，DHA或者OA的补充抑制了脑内ZIKVRNA和ZIKVE蛋白的表达，脑内神经元的数量也有所增加。以上结果表明，ZIKV感染细胞后，随着ZIKVE蛋白对Mfsd2a蛋白的降解，细胞对LPC-DHA及LPC-其他脂肪酸的转运功能因此减弱甚至丧失，hBMEC细胞及新生鼠脑内的脂质稳态受到破坏。 本课题在ZIKV感染对BBB中特异性转运体Mfsd2a表达和功能以及BBB脉管系统中脂质稳态的影响方面进行了深入的研究，我们利用一系列体内外实验，发现ZIKV利用其包膜E蛋白以泛素-蛋白酶体依赖的途径降解Mfsd2a蛋白，并初步阐明了ZIKV感染降解Mfsd2a蛋白的机制。此外，随着Mfsd2a蛋白的降解，细胞对LPC-DHA及LPC-其他脂肪酸的转运功能减弱甚至完全丧失，进而破坏了微血管内皮细胞和大脑内的脂质稳态;当在感染早期补充DHA后，能够缓解ZIKV感染所致的小头症表型。这提示，DHA可能为预防或者治疗ZIKV感染所致的神经系统性疾病的潜在药物。我们的研究成果为阐明ZIKV的致病性和发现新的寨卡热疾病治疗靶点提供了理论基础。
寨卡病毒;Mfsd2a;血脑屏障;小头症;DHA;致病机制
中国医学科学院北京协和医学院
博士
微生物学
杨威
2019
中文
R373
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）