中国多中心侵袭性感染光滑念珠菌复合体流行病学及棘白菌素耐药机制研究
目的:综合评估基因水平和蛋白水平技术对光滑念珠菌复合体菌种的鉴定能力;分析中国多中心侵袭性感染光滑念珠菌复合体的抗真菌药物敏感性;系统性研究光滑念珠菌的分子流行病学特征及对棘白菌素类药物的耐药机制。 方法:本研究选取了2009年8月至2014年7月五年参加CHIF-NET的11家监测中心收集的所有非重复侵袭性感染光滑念珠菌411株及所有参与医院收集的12株尼瓦利亚念珠菌(Candida nivariensis)和1株布加拉念珠菌(Candida bracarensis)。比较表型方法、基因测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对光滑念珠菌复合体的鉴定能力，并在菌种准确鉴定的基础上，测定菌株对9种抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。分子流行病学方面，利用多位点序列分析(MLST)和微卫星检测方法，对411株光滑念珠菌进行分子分型，并进行聚类及同源性分析;此外，收集CHIF-NET2015所有血流感染分离的光滑念珠菌158株，剖析PDR1和MSH2两个耐药相关基因在临床菌株中的突变率并分析其与氟康唑敏感性、分子型别的关系。耐药机制研究方面，检测411株光滑念珠菌FKS1和FKS2热点区(HS)基因的突变情况。本实验室报道了我国首例棘白菌素耐药光滑念珠菌(L74)引起的感染，L74的FKS1和FKS2扩增测序发现FKS1无义突变(W508stop)和FKS2非HS突变(E655K)。利用CRISPRCas9基因编辑技术在野生型菌株(ATCC 2001)上构建菌株CRISPR31(Fks1 WT/Fks2-E655K);利用同源重组定点突变技术在fks1Δ上构建菌株fks1Δ/Fks2-E655K，进而在葡聚糖合成酶的活性、转录水平、蛋白水平和体内动物实验四个层面深度阐明这株棘白菌素高耐菌的耐药机制。 结果:在我国，光滑念珠菌引起临床侵袭性感染的标本类型中，以血液为主，占比48.7％(200/411)。尼瓦利亚念珠菌和布加拉念珠菌属于罕见菌种，占总体分离念珠菌属＜0.2％，表型方法不能正确鉴定菌种，需依赖分子测序。VitekMSIVD和BrukerBiotyperMS无法将这两种菌准确鉴定至种水平;VitekMSRUO，BrukerClinProTools和自建库能够提高MALDI-TOFMS对尼瓦利亚念珠菌和布加拉念珠菌的鉴定能力。 体外抗真菌药物敏感性结果显示，光滑念珠菌氟康唑耐药率为16.5％，伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑非野生型(non-WT)分别为28.7％，6.8％和7.3％。14.8％(61/411)的菌株是氟康唑耐药且伏立康唑non-WT。2株菌(0.5％)对棘白菌素耐药，其中一株是高耐菌(L74)，对三种棘白菌素的MIC均≥8μg/ml;另一株是对唑类也耐药的多重耐药菌(MDR)(13GZ415)。所有菌株均是两性霉素B野生型(WT)，仅1株菌(0.2％)是5-氟胞嘧啶non-WT。5年间，光滑念珠菌对氟康唑的耐药率增长了近2倍，伏立康唑non-WT增长了近7倍。尼瓦利亚念珠菌和布加拉念珠菌对9种抗真菌药物的MIC均较低。 分子流行病学方面，MLST将411株光滑念珠菌分为35个序列型(ST)，包括24个新型别，其中ST7(66.4％)和ST3(9.5％)是我国侵袭性感染光滑念珠菌的主要型别。微卫星分析将411株菌分为79个不同的基因型，以T25(30.4％)和T31(12.4％)为主。菌株分子型别与分离部位和氟康唑敏感性无明显相关性。微卫星分析的分辨率高于MLST。氟康唑耐药株PDR1的突变率显著高于剂量依赖性敏感株(92.9％vs19.4％，P＜0.001)，PDR1基因型与菌株型别无关。MSH2基因型与菌株药物敏感性无明显相关性，但与ST和微卫星型别相关，所有的ST7(n=104)菌株均含有V239L突变，此外1株还存在K583N突变;所有ST10菌株(n=8)都有P208S/N890I突变。 棘白菌素耐药机制研究方面，我国光滑念珠菌FKS基因突变率很低，除高耐菌L74外，两株敏感菌有FKS1非HS突变，MDR菌(13GZ415)有FKS2HS1突变L662W。与野生型ATCC2001相比，CRISPR31菌株棘白菌素MIC仅轻微升高，FKSmRNA表达和Fks1/Fks2蛋白表达无明显差异，葡聚糖合成酶活性和体内动物试验均表现为低耐。L74菌株葡聚糖合成酶的活性在卡泊芬净或米卡芬净作用下无显著下降;FKS1基因转录水平表达下降，FKS2表达上调;Fks1/Fks2蛋白表达明显下降。构建菌株fks1ΔFks2-E655K在小鼠侵袭性光滑念珠菌感染模型中，表现为对米卡芬净治疗无应答(P＞0.05)。 结论:本研究证实了光滑念珠菌复合体中尼瓦利亚念珠菌和布加拉念珠菌的准确鉴定依赖于分子生物学的方法。我国侵袭性感染光滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率/non-WT呈现明显的升高趋势。临床分离光滑念珠菌以ST7和ST3为主，微卫星分型的分辨率高于MLST。PDR1基因型与菌株氟康唑耐药有关，MSH2基因型与分子型别相关。我国光滑念珠菌棘白菌素耐药率低，从体外试验和体内动物试验深度阐明临床棘白菌素高耐菌L74的主要耐药机制是FKS2E655K突变和FKS1功能缺失。
光滑念珠菌复合体;侵袭性念珠菌病;抗真菌药物;耐药机制;流行病学
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床检验诊断学
徐英春
2019
中文
R519;R446.5
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）