人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1抗原定量及免疫原性研究
世界范围内，宫颈癌为女性第四位高发恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素。HPV结构基因编码主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)，两者共同形成病毒的二十面体衣壳。外源表达的L1蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)，其超微结构和免疫原性与天然病毒类似，目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以上述HPVL1VLPs为基础。HPV预防性疫苗至少含有两个型别的L1抗原，甚至更多型别的L1抗原，所有HPV疫苗均含有HPV16L1抗原。本课题对多价疫苗中HPV16L1抗原的定量及免疫原性特点进行了深入研究，并得到以下结果。 1.HPV16L1抗原ELISA定量方法的建立与应用 目前已有三种HPV预防性疫苗在我国上市，国内还有9家企业15个品种的HPV预防性疫苗处于不同的研究阶段。现阶段各生产企业利用各自的HPV16型特异性单抗建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)以检测各自的HPV16L1抗原，使抗原检测结果差异大。因此急需筛选一株具有代表性的HPV16型特异性单抗以建立统一的ELISA抗原检测方法。比较分析13株具有中和活性的HPV16单抗，HPV16.001的中和活性最强，IC50为0.6ng/mL。从中和活性最强(IC50＜10ng/mL)的6株单抗中选择4个代表株进行结合特性分析，HPV16.001结合亲和力最高(EC50:2.6ng/mL)且结合最稳定，不受抗原表达系统的影响。竞争抑制实验表明HPV16.001识别HPV16VLPs上主要的中和表位而且能够代表免疫后血清中大部分中和抗体。以中和活性高、结合特性好而且具有表位优势的HPV16.001为基础，建立了统一的ELISA抗原检测方法。通过对线性、特异性和精密度等方法学参数进行验证，表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法适用于HPV16L1抗原的定量检测，可用于HPV16L1抗原鉴别和相对效价测定。 2.HPV多价联合疫苗中16型和18型L1抗原质谱定量方法的建立与应用 目前HPV预防性疫苗均是以HPVVLPs为基础的多价联合疫苗，从2价联合到14价联合。传统的蛋白定量方法，例如BCA法，无法区分定量每一型别HPVL1抗原。双抗体夹心ELISA法虽然可以区分定量各型别L1抗原，但筛选出针对10余种型别中每一型别L1抗原的特异性单抗耗时耗力，且ELISA法的定量易受疫苗中佐剂的影响。因此急需建立质谱检测方法，解决HPV多价联合疫苗中各型别L1抗原同时定量的问题。本研究基于稳定同位素标记的质谱定量的分析思路，在肽段基本筛选指标基础上，增加肽段特异性和质谱特性指标，确定HPV16L1和HPV18L1蛋白的定量特征肽段分别是AGAVGENVPDDLYIK和FSLDLDQYPLGR。使用稳定同位素标记的定量特征肽段作内标，建立了HPV多价联合疫苗中HPV16L1和HPV18L1蛋白的质谱检测方法。HPV单价样品和多价联合疫苗经0.1％RSF变性和胰蛋白酶酶解后，进行质谱测定，采用稳定同位素内标法定量。结果表明，HPV16L1和HPV18L1蛋白在20-500nM范围内线性关系良好，相关系数R2分别是0.998和0.995。方法的最低检测限分别为1.0nM和0.5nM，最低定量限分别为2.8nM和1.7nM，日内回收率分别为83.96％～113.57％和81.40％～100.43％，日间回收率分别为86.00％～100.20％和87.10％～103.49％，日内精密度分别为1.12％～4.65％和0.79％～5.91％，日间精密度分别为5.09％～10.59％和4.17％～11.05％。该质谱法测定的Gardasil中HPV16L1和HPV18L1蛋白的含量分别是46.9±0.8μg和17.2±0.28μg，Gardasil9中分别是51.2±2.0μg和33.2±0.6μg，均与标示量相近。本研究建立的质谱定量方法简单、快速、准确、灵敏，可同时定量HPV多价联合疫苗中的HPV16L1和HPV18L1蛋白。 3.HPV16L1抗原的免疫保护活性涵盖L1突变株的研究 随着HPV16病毒的进化，HPV16型内变异株越来越多。对截止至2016年底的所有1204个HPV16型内变异株L1蛋白的序列进行分析，发现505个氨基酸中，270个位点发生变异，变异率为0.08％～20.18％。为分析HPV16预防性疫苗株对这些自然点突变株的保护效果，利用定点突变技术构建39个点突变株，包括自然状态下的高频突变位点和表位相关突变位点。利用真核蛋白表达系统，成功包装31株高滴度HPV16突变假病毒。利用假病毒为基础的中和实验(PBNA)分析31株突变假病毒对单抗和免疫血清的中和敏感性变化。结果表明，21株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性发生变化，其中20株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性下降，8株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性上升，6株突变假病毒对某些单抗彻底失去了反应性。免疫血清虽然可中和上述31株单点突变假病毒，但C428W和K430Q两株突变假病毒对免疫血清的中和敏感性分别下降9倍和11倍。本部分结果表明，截至目前，HPV16预防性疫苗株尚能够诱导高效广谱的保护性免疫，但HPV16L1的抗原性正在发生变化，需要密切监测。
宫颈癌;人乳头瘤病毒16型;衣壳蛋白;双抗体夹心ELISA;定量特征肽段;型内变异
中国医学科学院北京协和医学院
博士
病原生物学
王佑春
2019
中文
R737.33
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）