TRPV1敏感性调节药物对咳嗽高敏综合征的治疗作用及机制的探讨
第一部分:咳嗽高敏综合征动物模型的建立 研究背景 咳嗽是机体的防御性神经反射，有利于清除呼吸道分泌物和有害因子，但频繁剧烈的咳嗽会对患者的工作、生活和社会活动造成严重影响，尤其是慢性咳嗽。根据流行病学调查，慢性咳嗽的患病率为10％，随地区或年龄而异。多数急慢性咳嗽患者可以获得明确的病因诊断，给予针对性治疗后症状缓解。然而，有12％-42％慢性咳嗽患者在进行了全面检查之后，病因仍无法明确，治疗困难，亟待进行深入研究。这类咳嗽被称为“难治性咳嗽”，2010年Moris提出“咳嗽高敏综合征”的概念。研究发现这类患者具备如下临床特征:1)咳嗽阈值降低;2)气道内TRPV1表达增高;3)体液内神经肽表达增高;4)组织病理没有诊断特异性。目前对咳嗽的临床前研究相对混乱，PM2.5、香烟烟雾、炎症介质是最常用的咳嗽诱导方法，但目前没有一个典型、稳定、公认的咳嗽模型，更没有一个成熟的咳嗽高敏综合征模型。缓激肽是一种炎症介质，与慢性阻塞性肺疾病、哮喘、ACEI类药物相关性咳嗽均相关，而后者具有咳嗽高敏感性，属于咳嗽高敏综合征的范畴。因此本实验尝试应用缓激肽诱导吸入的方法建立咳嗽高敏综合征动物模型。 研究方法 以雄性Hartly豚鼠为研究对象，利用超声雾化器给予雾化吸入缓激肽的方法诱导。第一步将10只豚鼠随机分为两组，如下:(1)生理盐水组:生理盐水雾化10分钟;(2)缓激肽组:以3mg/ml浓度雾化吸入缓激肽10分钟。计数雾化开始10分钟内咳嗽次数，检测缓激肽是否能够诱导咳嗽反射。第二步将另外10只豚鼠随机分为两组，如下:(3)生理盐水+辣椒素组:生理盐水雾化10分钟，30分钟后再以60uM浓度雾化辣椒素10分钟;(4)缓激肽组+辣椒素组:以3mg/ml浓度雾化缓激肽10分钟，30分钟后再以60uM的浓度雾化辣椒素10分钟。计数雾化缓激肽开始10分钟内咳嗽次数，检测缓激肽预处理是否影响豚鼠对辣椒素的咳嗽敏感性。雾化结束30分钟后，采集标本，应用ELISA方法检测血清、支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆中的TRPV1和NKA、CGRP、SP等神经肽表达水平。应用免疫组化方法检测气管组织、肺组织中TRPV1和NKA、CGRP、SP等神经肽表达水平。应用HE染色观察气管组织和肺组织的病理表现。结果以均数±标准差(X±SD)表示。所有数据均采用SPSS16.0软件进行分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。 研究结果 1.缓激肽诱导的咳嗽反射 1.1缓激肽对咳嗽次数的影响:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠咳嗽次数增加(p＜0.01)，咳嗽反射诱导成功; 1.2缓激肽对咳嗽反射过程TRPV1表达的影响:(1)ELISA结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠TRPV1在肺组织的表达增加(p＜0.05)，在支气管肺泡灌洗液中的表达增加(p＜0.01)，但两组在血液中的表达无统计学差异。(2)免疫组化结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠TRPV1在肺组织的表达增加(p＜0.01)，但两组在气管组织中的表达无统计学差异。 1.3缓激肽对咳嗽反射过程NKA表达的影响:(1)ELISA结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠NKA在肺组织的表达增加(p＜0.01)，在血液中的表达增加(p＜0.01)，但两组在支气管肺泡灌洗液中的表达无统计学差异。(2)免疫组化结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠NKA在肺组织的表达增加(p＜0.01)，但两组在气管组织的表达无统计学差异。 1.4缓激肽对咳嗽反射过程CGRP表达的影响:(1)ELISA结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠CGRP在支气管肺泡灌洗液中的表达增加(p＜0.05)，未发现在肺组织和血液中表达增加。(2)免疫组化结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠CGRP在气管组织的表达增加(p＜0.01)，但未发现在肺组织中的表达增加。 1.5缓激肽对咳嗽反射过程SP表达的影响:(1)ELISA结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠SP在肺组织、血液和支气管肺泡灌洗液中的表达均未见增加。(2)免疫组化结果:与生理盐水组相比，缓激肽组豚鼠SP在气管组织和肺组织的表达均未见增加。 1.6气管组织和肺组织病理观察:HE染色显示气管组织、肺组织的病理变化均为轻-中度炎症反应性改变:气管内衬粘膜上皮排列轻度紊乱，粘膜间质内中度混合炎细胞浸润，其中嗜酸粒细胞易见，粘膜下层水肿和小血管扩张淤血。在肺组织中发现肺泡扩张融合、肺泡腔内多少不等的炎性分泌物，肺泡间隔疏松水肿、部分毛细血管扩张淤血。但两组间无明显差异。 2.缓激肽诱导的咳嗽高敏综合征 2.1缓激肽对辣椒素刺激的咳嗽敏感性的影响:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠咳嗽次数增加(p＜0.01)，即对辣椒素刺激的咳嗽敏感性增加，咳嗽高敏综合征诱导成功; 2.2缓激肽诱导的咳嗽高敏综合征中TRPV1的表达:(1)ELISA结果:与生理盐水+辣椒素相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠TRPV1在肺组织的表达增加(p＜0.01)，在支气管肺泡灌洗液和血液中的表达均未见增加。(2)免疫组化结果:与生理盐水+辣椒素相比，缓激肽+辣椒素组组豚鼠TRPV1在肺组织的表达增加(p＜0.01)，在气管组织中的表达未见增加。 2.3缓激肽诱导的咳嗽高敏综合征中NKA的表达:(1)ELISA结果:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在肺组织的表达增加(p＜0.05)，在血液中的表达增加(p＜0.05)，但两组在支气管肺泡灌洗液中的表达无统计学差异。(2)免疫组化结果:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在肺组织的表达增加(p＜0.01)，但两组在气管组织中的表达无统计学差异。 2.4缓激肽诱导的咳嗽高敏综合征中CGRP的表达:(1)ELISA结果:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的表达增加(p＜0.01)，未发现在肺组织和支气管肺泡灌洗液中表达增加。(2)免疫组化结果:与生理盐水+辣椒素组相比,缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在气管组织和肺组织中的表达均未见增加。 2.5缓激肽诱导的咳嗽高敏综合征中SP的表达:(1)ELISA结果:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠SP在支气管肺泡灌洗液中的表达增加(P＜0.05)，未发现在肺组织和血液中表达增加。(2)免疫组化结果:与生理盐水+辣椒素组相比，缓激肽+辣椒素组豚鼠SP在气管组织的表达增加(p＜0.01)，但在肺组织的表达未见增加。 2.6气管组织和肺组织病理观察:HE染色显示气管组织、肺组织的病理变化均为轻-中度炎症反应性改变:气管内衬粘膜上皮排列轻度紊乱，粘膜间质内中度混合炎细胞浸润，其中嗜酸粒细胞易见，粘膜下层水肿和小血管扩张淤血。在肺组织中发现肺泡扩张融合、肺泡腔内多少不等的炎性分泌物，肺泡间隔疏松水肿、部分毛细血管扩张淤血。但两组间无明显差异。 研究结论 缓激肽不仅可以诱导咳嗽反射，还可以诱导咳嗽高敏综合症，均依赖于TRPV1-神经肽机制。缓激肽诱导的咳嗽高敏综合症模型，表现为TRPV1表达增加和神经肽表达增多，具有咳嗽高敏综合症患者的病理生理特点，咳嗽高敏综合症模型建立成功。 关键词:咳嗽高敏综合症;TRPV1;神经肽;NKA;CGRP;SP 第二部分:TRPV1敏感性调节化合物的咳嗽高敏综合征治疗效应评价 研究背景 临床研究发现在慢性咳嗽患者中，TRPV1表达增加，对辣椒素的刺激敏感性增加，且二者之间具有相关性。辣椒素通过特异性激活TRPV1来诱导咳嗽。TRPV1被称为瞬时感受器电位芳草酸受体1(transient receptor potential vanniloid receptor 1，TRPV1)，是近年来发现的最重要的咳嗽受体。目前，许多研究者已经开始开发用于治疗慢性咳嗽的TRPV1拮抗剂，其中一些已被证明在动物实验中有效，一些已进入临床试验。这些药物的主要缺点是过高热、热感觉受损、皮肤癌风险增加以及缺乏稳定的药代动力学和药效学。因此，慢性咳嗽的的治疗需要寻找新的突破点。本研究尝试探讨B2受体拮抗剂、PKC拮抗剂、细胞内钙离子螯合剂、薄荷醇等可调节TRPV1敏感性的化合物是否具有止咳作用。 研究方法 以雄性Hartly豚鼠为研究对象，实验分两步进行。第一步将30只豚鼠随机分为6组如下:(1)缓激肽组;(2)B2受体拮抗剂+缓激肽组;(3)PKC拮抗剂+缓激肽组;(4)钙离子螯合剂+缓激肽组;(5)TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组;(6)薄荷醇+缓激肽组。除空白对照组外，每组均给予不同的拮抗剂预先干预，1小时后给予缓激肽雾化，计数缓激肽雾化开始10分钟内咳嗽次数。第二步将另外30只豚鼠随机分为6组如下:(1)缓激肽+辣椒素组;(2)B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(3))PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(4)钙离子螯合剂+缓激肽+辣椒素组;(5)TRPV1受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(6)薄荷醇+缓激肽+辣椒素组。除空白对照组外，每组均给予不同的拮抗剂预先干预，1小时后给予缓激肽雾化10分钟，半小时后给予辣椒素雾化，计数开始10分钟内咳嗽次数。结果以均数±标准差(X±SD)表示。所有数据均采用SPSS16.0软件进行分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。 研究结果 1.TRPV1敏感性调节药物对咳嗽反射的抑制作用 与缓激肽组相比，各干预组的咳嗽次数均降低(p＜0.01)，即咳嗽反射受到抑制。 2.TRPV1敏感性药物对咳嗽高敏感性的抑制作用 与缓激肽+辣椒素组相比，各干预组的咳嗽次数均降低，即咳嗽敏感性受到抑制。B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组和薄荷醇+缓激肽+辣椒素组p＜0.05，PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组、钙离子螯合剂+缓激肽+辣椒素组和TRPV1受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组p＜0.01。 研究结论 除了TRPV1拮抗，B2受体拮抗剂、PKC拮抗剂、细胞内钙离子螯合剂、薄荷醇等TRPV敏感性调节药物也都具有抑制咳嗽反射和的咳嗽高敏感性的作用，因此对于咳嗽高敏综合征具有治疗作用。 关键词:咳嗽高敏综合症;TRPV1;神经肽;NKA;CGRP;SP 第三部分:TRPV1敏感性调节药物对咳嗽高敏综合征的治疗机制 研究背景 临床研究发现慢性咳嗽患者气道内TRPV1表达升高，体液内神经肽表达水平升高。体外实验研究发现，TRPV1受到炎症介质的作用，敏感性升高，使其更容易被各种刺激物激活，诱发咳嗽反射。而TRPV1的激活可引起C纤维末端释放神经激肽A(NKA)、P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)等神经肽物质，引起神经源性炎症，构成发生咳嗽的机制之一。本实验尝试探讨TRPV1敏感性调节药物B2受体拮抗剂、PKC拮抗剂、细胞内钙离子螯合剂、薄荷醇是否抑制TRPV1和神经肽的表达，明确其止咳机制。 研究方法 以雄性Hartly豚鼠为研究对象，实验分两步进行。第一步将30只豚鼠随机分为6组如下:(1)缓激肽组;(2)B2受体拮抗剂+缓激肽组;(3))PKC拮抗剂+缓激肽组;(4)钙离子螯合剂+缓激肽组;(5)TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组;(6)薄荷醇+缓激肽组。除空白对照组外，每组均给予不同的拮抗剂预先干预，1小时后给予缓激肽雾化10分钟。第二步将另外30只豚鼠随机分为6组如下:(1)缓激肽+辣椒素组;(2)B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(3))PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(4)钙离子螯合剂+缓激肽+辣椒素组;(5)TRPV1受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组;(6)薄荷醇+缓激肽+辣椒素组。除空白对照组外，每组均给予不同的拮抗剂预先干预，1小时后给予缓激肽雾化10分钟，半小时后给予辣椒素雾化10分钟。雾化结束30分钟后，采集标本，应用ELISA方法检测血清、支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆中的TRPV1和NKA、CGRP、SP等神经肽表达水平。应用免疫组化方法检测气管组织、肺组织中TRPV1和NKA、CGRP、SP等神经肽表达水平。结果以均数±标准差(X±SD)表示。所有数据均采用SPSS16.0软件进行分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。 研究结果 1.TRPV1敏感性调节药物对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 1.1B2受体拮抗剂对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽组，B2受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠TRPV1在支气管肺泡灌洗液中表达减少(p＜0.05)，而在肺组织中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽组，B2受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.05)和免疫组化实验结果(p＜0.05)均呈现相同趋势，在血液中表达也减少(p＜0.05)。 1.2PKC拮抗剂对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽组，PKC拮抗剂+缓激肽组豚鼠TRPV1在肺组织中表达减少(p＜0.05)，ELISA实验(p＜0.05)和免疫组化实验结果(p＜0.01)均呈现相同趋势，而在支气管肺泡灌洗液中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽组，PKC拮抗剂+缓激肽组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.01)和免疫组化实验结果(p＜0.01)均呈现相同趋势，在血液中表达也减少(p＜0.01)。 1.3钙离子螯合剂对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽组，钙离子螯合剂+缓激肽组豚鼠TRPV1在支气管肺泡灌洗液中表达减少(p＜0.05)，而在肺组织中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽组，钙离子螯合剂+缓激肽组豚鼠NKA在血液中的表达减少(p＜0.01)，在肺组织中的表达未见减少。 (3)相比缓激肽组，钙离子螯合剂+缓激肽组豚鼠CGRP在气管组织(p＜0.05)和BALF(p＜0.05)中的表达均减少。 1.4TRPV1受体拮抗剂对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽组，TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠支气管肺泡灌洗液中TRPV1表达减少(p＜0.01)，而在肺组织中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽组，TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.01)和免疫组化实验结果(p＜0.01)均呈现相同趋势，在血液中表达也减少(p＜0.01)。 1.5薄荷醇对咳嗽反射中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽组，TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠支气管肺泡灌洗液中TRPV1表达减少(p＜0.05)，而在肺组织中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽组，TRPV1受体拮抗剂+缓激肽组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.01)和免疫组化实验结果(p＜0.05)均呈现相同趋势，在血液中表达也减少(p＜0.01)。 2.TRPV1敏感性调节药物对咳嗽高敏综合征中TRPV1和神经肽表达的抑制作用。 相比缓激肽+辣椒素组，各组豚鼠TRPV1的表达未见减少。 2.1B2受体拮抗剂对咳嗽高敏综合征中神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽+辣椒素组，B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.05)和免疫组化实验结果(p＜0.05)均呈现相同趋势。NKA在血液中的表达未发现减少。 (2)相比缓激肽+辣椒素组，B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的的表达减少(p＜0.01)。 (3)相比缓激肽+辣椒素组，B2受体拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠SP在气管(p＜0.05)和支气管肺泡灌洗液(p＜0.05)中的表达均减少。 2.2PKC拮抗剂对咳嗽高敏综合征中神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽+辣椒素组，PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.05)和免疫组化实验结果(p＜0.01)均呈现相同趋势，在血液中的表达也减少(p＜0.01)。 (2)相比缓激肽+辣椒素组，PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的的表达减少(p＜0.01)。 (3)相比缓激肽+辣椒素组，PKC拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠SP在气管(p＜0.05)和支气管肺泡灌洗液(p＜0.01)中的表达均减少。 2.3钙离子螯合剂对咳嗽高敏综合征中神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽+辣椒素组，钙离子螯合剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在血液中的表达减少(p＜0.01)，在肺组织中的表达未见减少。 (2)相比缓激肽+辣椒素组，钙离子螯合剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的的表达减少(p＜0.01)。 2.4TRPV1拮抗剂对咳嗽高敏综合征中神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽+辣椒素组，TRPV1拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的表达减少(p＜0.01)。 (2)相比缓激肽+辣椒素组，TRPV1拮抗剂+缓激肽+辣椒素组豚鼠SP在气管(p＜0.05)和支气管肺泡灌洗液(p＜0.01)中的表达均减少。 2.5薄荷醇对咳嗽高敏综合征中神经肽表达的抑制作用。 (1)相比缓激肽+辣椒素组，薄荷醇+缓激肽+辣椒素组豚鼠NKA在肺组织中的表达减少，ELISA实验(p＜0.05)和免疫组化实验结果(p＜0.05)均呈现相同趋势，在血液中的表达也减少(p＜0.01)。 (2)相比缓激肽+辣椒素组，薄荷醇+缓激肽+辣椒素组豚鼠CGRP在血液中的的表达减少(p＜0.01)。 研究结论 不仅TRPV1拮抗剂，TRPV1敏感性调节药物如BK2受体拮抗剂、PKC拮抗剂、细胞内钙离子螯合剂、薄荷醇均不同程度抑制了咳嗽反射和咳嗽高敏综合症中神经肽的表达，此为其治疗机制之一。
咳嗽高敏综合症;TRPV1;神经肽;分子机制;动物实验
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床医学（内科学）
孙铁英
2018
中文
R-332;R56
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）