同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清孕酮与载脂蛋白B研究
第一部分同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清孕酮——一种候选参考方法的建立与应用 目的:建立同位素稀释高效液相色谱串联质谱(Isotope Dilution Liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID LC/MS/MS)测定血清孕酮的参考方法，并开展与常规免疫方法的比对研究，评价孕酮相关制备物的互通性，为我国临床实验室孕酮检测的标准化提供理论依据，并且为我国室间质量评价(External Quality Assessment，EQA)计划及标准化计划遴选合适的质评材料。 方法:用配制的孕酮标准溶液和相关的干扰物摸索色谱质谱条件。前处理过程考察了固相萃取和液液萃取。方法确认过程评价了不精密度，正确度，回收率，基质效应，检测限和定量限，不确定度等指标。方法的应用包括与常规方法的比对以及评价参考物质的互通性。采用单人份血清作为方法学比对和互通性评价的样本，待评价的常规系统包括国内和国外品牌的主流分析系统，待评价互通性的物质有:(1)新鲜冰冻混合人血清;(2)有证标物;(3)动物血清;(4)室间质量评价质控材料;(5)市售第三方质控品;(6)去激素血清;(7)环糊精水溶液。以本研究所建的IDLC/MS/MS方法作为比对方法，其测定的新鲜冰冻血清样本结果为X轴，以5种常规方法测定结果为Y轴，运用最小二乘法(OLS)进行简单线性回归并计算双侧95％预测区间，通过比较剩余标准差与总分析不精密度，以及偏倚等，分析当前常规免疫学方法存在的主要问题;互通性评价采用了两种方法，分别为传统的统计学方法，即双侧95％预测区间和国际临床化学联合会(International Federation Of Clinical Chemistry，IFCC)推荐的偏倚差值法。 结果:孕酮的液相色谱分离采用WatersSymmetryC18色谱柱(3.5μm，2.1×100mm)，流速0.2mL/min，流动相为水(含0.01％乙酸)∶乙腈(v∶v)=35∶65，柱温25℃。此条件下孕酮的保留时间为5.50min。在API5000质谱仪，电喷雾离子源多反应监测模式下，选取m/z315.4→109.2和m/z318.4→112.4作为定量离子对，m/z315.4→97.1和m/z318.4→100.1作为定性离子对。确定的前处理过程为正己烷提取血清孕酮，再用环糊精提取，最后萃取到甲苯中，氮气下吹干，流动相重组后上样检测。最后用包括法定量。方法的批内和总不精密度分别为0.50％-0.58％，0.71％-1.33％。方法相对回收率为99.08％-101.50％。方法比对实验中，6种常规方法与IDLC/MS/MS方法拟合的回归方程的斜率范围为0.96-1.26，截距为-1.14-0.89ng/mL。部分常规系统在低浓度下剩余标准差是分析不精密度的20倍。6个系统的偏倚范围为-0.20-4.06ng/mL，相对偏倚在-1.40-18.85％。 互通性评价方面，采用传统95％预测区间的方法，自制混合病人血清，国际冻干人血清标物ERMDA347，BCR348R，国内冰冻人血清标物GBW09197，09198，09199，以及商品化的去激素血清在6个系统上都具有互通性。环糊精水溶液明显超出预测区间的下限。使用IFCC推荐的偏倚差值法进行互通性评价时，没有一个制备物在6个系统上都表现出互通性。 结论:本研究建立了孕酮的同位素稀释液相色谱串联质谱法，方法检测时间短，结果准确可靠。依据建立的方法，对常规免疫方法进行评价，发现多数免疫方法存在校准偏倚和特异性问题。通过对制备物互通性的评价，发现新鲜冰冻混合人血清在6个评价的系统中均具有良好的互通性。IFCC推荐的偏倚差值法与95％PI方法的互通性评价结果有一定差异。 关键词:孕酮;参考方法;同位素稀释液相色谱串联质谱;免疫法;偏倚;互通性 第二部分同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清载脂蛋白B——样本制备的初步研究 目的:研究血清载脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)和特定apoB肽段胰蛋白酶酶解过程，考察蛋白或肽段酶解动力学，优化apoB肽段液相色谱质谱分析条件，探索蛋白类检验项目准确定量时的样本制备程序，为蛋白质的参考测量研究提供实验基础。 方法:根据相关文献及数据库选择4种apoB的特异性片段(目标肽段)。人工合成目标肽段、同位素标记目标肽段(用作内标)。利用合成的目标肽段优化色谱质谱分析条件。将血清适量内标混合，在不同酶解条件(胰蛋白酶制剂种类、用量及酶解过程和温度等)下反应不同时间，经脱盐等处理后进行色谱质谱分析，记录目标肽段和内标肽段的绝对峰面积，计算峰面积比值，分析绝对峰面积和峰面积比值随时间的变化。 结果:本研究选定的特异性片段及其内标分别为TEVIPPLIENR，TGISPLALIK，SVSLPSLDPASAK,FPEVDVLTK和TEVIPPL*IENR,TGISPL*ALIK,SVSLPSL*DPASAK，FPEVDVL*TK(*代表同位素标记的氨基酸，使用13C和15N同时标记了该氨基酸的6个C和1个N)。研究发现不同种类的酶对水解效率有很大影响，进而影响整个反应的时间。通过选择合适的胰蛋白酶，在70℃反应条件下，目标肽段在30min内即可达到最大绝对峰面积，峰面积比也达到最大值。在血清样本中，4h内目标肽段的绝对峰面积稍有下降趋势，其中一个肽段(TG ISPLALIK)及其同位素内标肽段的绝对峰面积下降比较明显，达70％。在30min到4h的反应时间内，四个肽段的同位素比基本保持稳定。 结论:本实验初步研究了液相色谱质谱法测定apoB色谱质谱参数和样本制备条件，通过选择合适的胰蛋白酶，优化反应条件，可以在30min内达到最大的水解程度。该结果提示使用目标肽段作为校准品的可行性，有望通过进一步的氨基酸分析实现向国际单位制(SI)的溯源，从而实现复杂大分子蛋白的准确定量。
孕酮;载脂蛋白B;液相色谱串联质谱;氨基酸分析
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床检验诊断学
陈文祥
2019
中文
R446.6;O657.63
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）