同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清孕酮与载脂蛋白B研究
第一部分同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清孕酮——一种候选参考方法的建立与应用 目的:建立同位素稀释高效液相色谱串联质谱(Isotope Dilution Liquid chromatography tandem mass spectrometry,ID LC/MS/MS)测定血清孕酮的参考方法,并开展与常规免疫方法的比对研究,评价孕酮相关制备物的互通性,为我国临床实验室孕酮检测的标准化提供理论依据,并且为我国室间质量评价(External Quality Assessment,EQA)计划及标准化计划遴选合适的质评材料。 方法:用配制的孕酮标准溶液和相关的干扰物摸索色谱质谱条件。前处理过程考察了固相萃取和液液萃取。方法确认过程评价了不精密度,正确度,回收率,基质效应,检测限和定量限,不确定度等指标。方法的应用包括与常规方法的比对以及评价参考物质的互通性。采用单人份血清作为方法学比对和互通性评价的样本,待评价的常规系统包括国内和国外品牌的主流分析系统,待评价互通性的物质有:(1)新鲜冰冻混合人血清;(2)有证标物;(3)动物血清;(4)室间质量评价质控材料;(5)市售第三方质控品;(6)去激素血清;(7)环糊精水溶液。以本研究所建的IDLC/MS/MS方法作为比对方法,其测定的新鲜冰冻血清样本结果为X轴,以5种常规方法测定结果为Y轴,运用最小二乘法(OLS)进行简单线性回归并计算双侧95%预测区间,通过比较剩余标准差与总分析不精密度,以及偏倚等,分析当前常规免疫学方法存在的主要问题;互通性评价采用了两种方法,分别为传统的统计学方法,即双侧95%预测区间和国际临床化学联合会(International Federation Of Clinical Chemistry,IFCC)推荐的偏倚差值法。 结果:孕酮的液相色谱分离采用WatersSymmetryC18色谱柱(3.5μm,2.1×100mm),流速0.2mL/min,流动相为水(含0.01%乙酸)∶乙腈(v∶v)=35∶65,柱温25℃。此条件下孕酮的保留时间为5.50min。在API5000质谱仪,电喷雾离子源多反应监测模式下,选取m/z315.4→109.2和m/z318.4→112.4作为定量离子对,m/z315.4→97.1和m/z318.4→100.1作为定性离子对。确定的前处理过程为正己烷提取血清孕酮,再用环糊精提取,最后萃取到甲苯中,氮气下吹干,流动相重组后上样检测。最后用包括法定量。方法的批内和总不精密度分别为0.50%-0.58%,0.71%-1.33%。方法相对回收率为99.08%-101.50%。方法比对实验中,6种常规方法与IDLC/MS/MS方法拟合的回归方程的斜率范围为0.96-1.26,截距为-1.14-0.89ng/mL。部分常规系统在低浓度下剩余标准差是分析不精密度的20倍。6个系统的偏倚范围为-0.20-4.06ng/mL,相对偏倚在-1.40-18.85%。 互通性评价方面,采用传统95%预测区间的方法,自制混合病人血清,国际冻干人血清标物ERMDA347,BCR348R,国内冰冻人血清标物GBW09197,09198,09199,以及商品化的去激素血清在6个系统上都具有互通性。环糊精水溶液明显超出预测区间的下限。使用IFCC推荐的偏倚差值法进行互通性评价时,没有一个制备物在6个系统上都表现出互通性。 结论:本研究建立了孕酮的同位素稀释液相色谱串联质谱法,方法检测时间短,结果准确可靠。依据建立的方法,对常规免疫方法进行评价,发现多数免疫方法存在校准偏倚和特异性问题。通过对制备物互通性的评价,发现新鲜冰冻混合人血清在6个评价的系统中均具有良好的互通性。IFCC推荐的偏倚差值法与95%PI方法的互通性评价结果有一定差异。 关键词:孕酮;参考方法;同位素稀释液相色谱串联质谱;免疫法;偏倚;互通性 第二部分同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清载脂蛋白B——样本制备的初步研究 目的:研究血清载脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)和特定apoB肽段胰蛋白酶酶解过程,考察蛋白或肽段酶解动力学,优化apoB肽段液相色谱质谱分析条件,探索蛋白类检验项目准确定量时的样本制备程序,为蛋白质的参考测量研究提供实验基础。 方法:根据相关文献及数据库选择4种apoB的特异性片段(目标肽段)。人工合成目标肽段、同位素标记目标肽段(用作内标)。利用合成的目标肽段优化色谱质谱分析条件。将血清适量内标混合,在不同酶解条件(胰蛋白酶制剂种类、用量及酶解过程和温度等)下反应不同时间,经脱盐等处理后进行色谱质谱分析,记录目标肽段和内标肽段的绝对峰面积,计算峰面积比值,分析绝对峰面积和峰面积比值随时间的变化。 结果:本研究选定的特异性片段及其内标分别为TEVIPPLIENR,TGISPLALIK,SVSLPSLDPASAK,FPEVDVLTK和TEVIPPL*IENR,TGISPL*ALIK,SVSLPSL*DPASAK,FPEVDVL*TK(*代表同位素标记的氨基酸,使用13C和15N同时标记了该氨基酸的6个C和1个N)。研究发现不同种类的酶对水解效率有很大影响,进而影响整个反应的时间。通过选择合适的胰蛋白酶,在70℃反应条件下,目标肽段在30min内即可达到最大绝对峰面积,峰面积比也达到最大值。在血清样本中,4h内目标肽段的绝对峰面积稍有下降趋势,其中一个肽段(TG ISPLALIK)及其同位素内标肽段的绝对峰面积下降比较明显,达70%。在30min到4h的反应时间内,四个肽段的同位素比基本保持稳定。 结论:本实验初步研究了液相色谱质谱法测定apoB色谱质谱参数和样本制备条件,通过选择合适的胰蛋白酶,优化反应条件,可以在30min内达到最大的水解程度。该结果提示使用目标肽段作为校准品的可行性,有望通过进一步的氨基酸分析实现向国际单位制(SI)的溯源,从而实现复杂大分子蛋白的准确定量。
孕酮;载脂蛋白B;液相色谱串联质谱;氨基酸分析
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床检验诊断学
陈文祥
2019
中文
R446.6;O657.63
2020-06-15(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)