新型复合乳佐剂的制备及其在狂犬病疫苗中的运用和机制研究
狂犬病是由狂犬病毒感染引起的全球范围内广泛流行的人兽共患病，患者发病后病死率接近于100％。狂犬病毒感染后先在局部肌肉组织中复制和扩散，然后迅速沿末梢神经和神经周围间歇的体液上行进入中枢神经系统，上行过程中病毒在神经节细胞中大量复制。由于中枢神经系统被内皮细胞紧密包裹，中和抗体，补体蛋白等特异性免疫应答成分难以进入其中发挥作用，而且其中缺乏巨噬细胞，炎性因子等非特异性免疫应答成分。因此，一旦病毒进入中枢神经，即便机体产生了高滴度的中和抗体也不能为机体提供有效保护。目前广泛使用的无佐剂狂犬病疫苗往往要到14DPI(day post inoculation)才能达到100％的阳转率，而在上世纪使用的铝佐剂狂犬病疫苗要到42DPI才能达到100％的阳转率。探索能够激发机体快速或者持久产生特异性和非特异性免疫应答的佐剂对于狂犬病的防控至关重要。 本研究将狂犬病疫苗毒株CTN-1-D15接种到人胚肺二倍体细胞中培养制备抗原。然后通过细胞ELISA方法检测抗狂犬病毒抗体以筛选佐剂成分，发现100μg/mL紫杉醇在3DPI抗体滴度OD平均值为0.717，采用方差分析发现:它与其它佐剂成分实验组之间差异显著(p＜0.01)，表明紫杉醇具有快速刺激抗体的能力;MF59在14DPI使抗体滴度OD平均值为0.945，与无佐剂组(OD平均值为0.493)比较其差异显著(p＜0.01)，说明它能刺激机体高水平中和抗体的产生。鉴于紫杉醇和MF59具有细胞毒性和过敏反应及持久性差的问题，本研究将二者联合以降低它们的使用浓度;另外辅酶Q10能够稳定细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性，它不但有利于三羧酸循环代谢而且利于线粒体驱动巨噬细胞产生炎性因子。 配制时采用角鲨烯萃取混悬液中的辅酶Q10，再按照体积比(5.0％角鲨烯;0.5％吐温;0.5％司班)混匀后分散在琥珀酸-柠檬酸钠缓冲液中，然后在800psi条件下通过高压均质机使其达到水包油(O/W)的状态，再用0.01M的PBS稀释1倍后加入20μg/mL的紫杉醇制备而成，因其制备环节呈金黄色故命名为Golden05。 将狂犬病Golden05佐剂疫苗分别在第0，3和7天对ICR小鼠进行肌肉免疫。然后用快速免疫荧光抑制灶试验(RFFIT)监测小鼠血清中和抗体滴度变化趋势，发现实验动物在5DPI时开始产生有效的中和保护抗体(0.83 IU/mL)，当完成三针注射后的28DPI时，抗体水平达到2.86IU/mL，连续监测至免疫后第3个月，抗体均能够维持在较高水平(2.05 IU/mL)。并在14DPI时，使用狂犬病标准攻毒株CVS-11对免疫后小鼠进行挑战试验，结果显示狂犬病Golden05佐剂疫苗的保护效果达到100％。 分析其免疫学机制发现Golden05能显著提高体内细胞线粒体的SDH活性，并能够提高机体IFN-γ，TNF等前炎性因子的表达，产生非特异性免疫应答;同时促进CD8+T细胞的大量增殖，从而使浆细胞活化，能快速大量地产生中和抗体，激活特异性免疫应答。并在物理化学和动物安全性评价中，Golden05具有良好的稳定性和安全性。 本研究通过维持细胞SDH活性，改良MF59并联合紫杉醇制备的复合乳佐剂能够快速且持久地诱导机体产生抗狂犬病毒特异性和非特异性的保护性免疫应答。
狂犬病疫苗;复合乳佐剂;琥珀酸脱氢酶;免疫效果;病毒抗体
中国医学科学院北京协和医学院
博士
病原生物学
廖国阳
2019
中文
R512.99
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）