46，XY性发育异常的基因突变研究及NR5A1基因罕见变异的体外功能验证
背景： 46，XY性发育异常(disorders of sex development，DSD)患者主要以外生殖器男性化不足为特征，可有性腺发育异常，伴或不伴苗勒氏管结构。其遗传背景复杂，目前已发现30余个相关致病基因，由于不同基因突变患者临床表型缺乏特异性，准确的诊断依赖基因测序技术。传统的一代测序通量低，测序成本高，对46，XYDSD患者突变基因检出率不超过20％。因此，选用适当的基因测序方法来提高该类患者基因检出率具有重要意义。NR5A1(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1)基因突变是46，XYDSD较为常见的病因，其发生率约为10-20％。NR5A1是一种关键的转录因子，调控多种类固醇激素合成及性发育相关基因的表达，对下丘脑-垂体-肾上腺及性腺的发育有重要作用。研究NR5A1基因突变患者临床特征及突变位点的致病性，有助于提高对该类疾病及NR5A1蛋白重要功能位点的认识。 目的： 本研究将对46，XYDSD患者进行致病基因突变的筛查，以明确该类患者致病基因的分布及其发生率;分析NR5A1基因突变患者临床表型，同时对NR5A1突变蛋白进行体外功能实验，验证其致病性。 方法： 2016年11月至2018年4月，在北京协和医院内分泌科性腺门诊招募46，XY性发育异常患者，收集患者的一般临床资料。采集外周血提取白细胞DNA。设计与性发育相关的基因外显子区域的特异性的捕获探针。采用目标基因外显子捕获，联合二代测序的方法，筛选患者的致病基因。进一步用Sanger测序方法验证变异位点。利用双荧光素酶报告系统及微基因报告系统进行细胞实验，分别验证突变型NR5A1对其靶基因CYP11A1转录调节功能的影响及突变对NR5A1基因RNA剪接的影响。 结果： (1)本研究共纳入46，XYDSD患者18例，其中10例患者检测到46，XYDSD相关基因突变，基因突变检出率为56％。AR基因和SRD5A2基因突变患者各3例，突变发生率为16.7％,NR5A1、LHCGR、CYP17A1、MAP3K1基因突变各检出1例，发生率为5.6％。 (2)在前期研究基础上，纳入12例检测到NR5A1基因罕见变异的46，XYDSD患者，所有患者均表现为性发育异常，不存在肾上腺皮质功能减退的症状。其中2例患者为男性社会性别，10例患者为女性社会性别。体格检查显示5例患者外生殖器表现为完全女性外阴，3例患者表现为阴蒂肥大，3例患者为外生殖器难辨，1例患者表现为尿道下裂。所有患者性腺为睾丸，45％的患者存在苗勒氏管结构。激素检查显示，除3例患者处于青春发育前期及1例患者处于微小青春期外，其余患者均存在促性腺激素水平升高，2例患者血睾酮水平处于正常范围。 (3)41.7％(5/12例)的NR5A1基因突变为已知致病突变，包括p.Ser32Asn，p.Gly35Asp,p.Asn44del,p.Arg84Cys及p.Leu233_Glu234insLeuGlnLeu。58.3％(7/12例)的罕见变异未见数据库报道，包括p.Ser21Phe，p.Lys45Glu，p.Ala82Ser，p.Arg89Ser，p.Gly91Asp，p.Arg255Profs*44和p.Gln362Serfs*20。体外双荧光素酶报告系统结果显示4例罕见错义变异仅Gly91Asp突变使NR5A1转录活性降低为野生型的39％;Ser21Phe突变体转录活性为野生型的76％，Ala82Ser和Arg89Ser突变体转录活性与野生型无差异。微基因报告系统结果显示c.244G＞A(Ala82Ser)导致NR5A1基因2号外显子剪接异常，出现3'末端19个碱基或整个2号外显子缺失的剪接体。 结论： 目的基因外显子捕获联合二代测序是对46，XYDSD患者进行基因突变筛查的有效方法，其突变检出率约为56％。在本研究队列中，AR和SRD5A2基因突变较为常见，约占46，XYDSD患者一半以上。NR5A1基因突变患者主要表现为性发育异常，未见肾上腺功能减退。分别有1个罕见变异影响NR5A1对CYP11A1的转录活性或NR5A1基因的RNA剪接，提示有必要通过功能实验验证罕见变异对蛋白质功能的影响，从而准确评估罕见变异的致病性。
46,XY性发育异常;基因突变;NR5A1基因;体外功能验证
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
内分泌与代谢学
聂敏
2019
中文
R588
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）