孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用
早期胚胎停育，又称稽留流产(missed abortion，MA)，是指妊娠早期胚胎停止发育、胚胎未见孕囊或心血管搏动等，是一种特殊类型的自然流产。我国MS的临床发病率为13％，且近年来呈现上升趋势，已经成为育龄妇女面临的一个重大健康问题。然而，但MA发生的确切机制至今尚未完全清楚。胎盘是妊娠期保证胎儿正常生长发育的临时性器官，是胎儿与母体进行营养和气体交换的唯一渠道。在胚胎发育过程中胎盘血管的形成和发育程度与妊娠的成功与否关系密切。胎盘发育异常是引起稽留流产的一个重要原因。在稽留流产中胎盘的病理生理变化尚不十分清楚，并且胎盘异常发生的分子机制也有待深入研究。MicroRNA(miRNA)是一种仅有18-25个核苷酸的内源性单链小分子RNA，广泛存在真核生物中，具有高度的保守性、组织特异性和时序性，在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中发挥着重要的作用。我们实验室的前期研究显示胎盘miRNAs异常表达参与了妊娠糖尿病的发生，而同样作为妊娠期相关疾病的稽留流产，miRNAs在其胎盘组织异常发育过程中的作用尚不明确。 为了观察MA胎盘绒毛组织的病理学变化，采用免疫组化法检测了标记胎盘血管生成和滋养层细胞入侵情况的血管内皮生长因子(VEGF)、反应滋养层细胞分布情况的细胞角蛋白(CK19)和反应蜕膜间充质细胞分布情况的波形蛋白(Vimentin)在MA患者和正常早孕对照绒毛组织中的表达差异;通过Tunel检测法测定了MS患者和正常对照胎盘绒毛组织的凋亡情况。结果显示，VEGF、CK19及Vimentin在胚胎停育的胎盘绒毛组织及正常对照绒毛组织中均有表达，VEGF的阳性信号主要定位于绒毛滋养细胞(包括细胞滋养细胞和合体滋养细胞)及间质细胞，CK19主要表达于滋养层细胞，Vimentin在间充质细胞及血管内皮细胞中表达丰富。利用H-score评分分析病例组及对照组的VEGF、CK19及Vimentin表达差异发现，病例组VEGF的表达水平显著低于对照组(P＜0.001)，其与已经报道的自然流产中VEGF表达水平较低的研究结果相一致。对照组及病例组的CK19和Vimentin表达没有明显差异。在MA患者及正常早孕对照胎盘绒毛中均存在细胞凋亡，病例组的凋亡指数显著高于对照组(P＜0.001)。这些结果提示MA发生时胎盘血管形成和绒毛滋养层细胞入侵受阻，滋养层细胞发生凋亡，其可能引起绒毛生长受限、侵袭不足，阻碍孕卵发育，从而发生胚胎停育。 为了研究MA患者胎盘异常发育的分子机制，我们首先筛选了在MA患者胎盘组织中差异表达的miRNAs。miRNA探针原位杂交和RT-PCR方法被用来检测miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者胎盘中的表达。原位杂交结果显示miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者及正常早孕绒毛组织中的均有广泛表达，主要分布于细胞滋养层细胞、合体滋养层及间质细胞。对miRNAs的阳性信号进行平均光密度统计分析发现，与对照组相比，miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a的表达在MA患者绒毛组织中均有显著升高(均P＜0.05)。Real-timePCR结果显示miR-98、miR-16和miR-125a在对照组和病例组间的表达差异与其原位杂交结果一致(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。这些结果提示miR-98、miR-16和miR-125a表达上调可能是引起胚胎停育的相关因素。我们实验室前期的研究结果显示miR-98和miR-125a在胚胎植入和复发性流产中发挥重要作用，故本研究选择miR-98和miR-125a进行深入研究。为了进一步分析这些miRNAs与MA的关系，我们研究了miRNAs在滋养层细胞中的作用及机制。Edu、MTT、transwell小室法被用来分析miRNA对人绒毛滋养细胞功能的影响;miRWalk、targetscan数据库被用来预测miRNA的靶基因;双荧光素酶报告基因检测系统和Real-timePCR被用来鉴定及验证miRNA的靶基因;基因补偿实验被用来进一步证实miRNAs与靶基因的作用关系。研究结果显示，过表达miR-98，滋养层细胞HTR8的迁移能力及活性显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，敲低miR-98，HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高(P＜0.05，P＜0.05)，提示miR-98对细胞、增殖及迁移起抑制作用。生物信息学预测显示GDF6和PLEKHA8是miR-98的靶基因。利用双荧光素酶系统验证显示，含GDF63'UTR种子序列的重组质粒与miR-98模拟物共转染可以显著降低荧光素酶活性(P＜0.01)，与miR-98抑制物共转染可以显著增加荧光素酶活性(P＜0.05)，提示miR-98能够与GDF63'UTR发生结合。突变预测的miR-98与GDF63'UTR识别序列，荧光素酶的活性显著增加(P＜0.05)，提示该位点突变可以抑制miR-98与GDF63'UTR结合。miR-98过表达，可以降低细胞中GDF6mRNA表达水平(P＜0.001)，敲低miR-98，GDF6表达量显著升高(P＜0.05)。这些结果提示GDF6为miR-98靶基因。同样，双荧光素酶实验显示miR-98过表达可以显著抑制PLEKHA8的活性(P＜0.05)，敲低可以明显促进PLEKHA8的活性(P＜0.05)，突变miR-98识别的PLEKHA83'UTR位点，可以显著抑制miR-98与PLEKHA83'UTR结合(P＜0.001)。qRT-PCR结果显示miR-98过表达可以降低细胞中PLEKHA8mRNA表达水平(P＜0.001)，miR-98低表达可以显著升高PLEKHA8mRNA表达水平(P＜0.05)。这些结果提示PLEKHA8为miR-98靶基因。靶基因RESCUE实验显示，敲低miR-98的同时抑制其靶基因PLEKHA8表达，可以使细胞增殖和迁移能力恢复到正常水平。过表达miR-125a，HTR8细胞的迁移能力及增殖显著降低(P＜0.05，P＜0.05)，敲低miR-125a，HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高(P＜0.05，P＜0.05)，说明miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用。过表达miR-125a可以抑制CBX7的表达，提示CBX7可能是miR-125a的靶基因。 结论:胚胎停育的患者中，滋养层细胞与间质细胞的分布没有明显变化，而绒毛滋养细胞侵袭能力下降，细胞过度凋亡，说明VEGF低表达和细胞凋亡异常与MA发生相关;miR-98、miR-16和miR-125a的过表达参与了MA的发生;miR-98和miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用，miR-98通过下调GDF6及PLEKHA8发挥作用，miR-125a通过调节CBX7发挥作用。
胚胎停育;绒毛组织;病理学变化;miRNA;异常发育
中国医学科学院北京协和医学院
博士
遗传学
罗文
2018
中文
R714.21
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）