CAPS基因突变与复发性流产的相关性研究
第一部分基于近亲婚配家系识别复发性流产的致病基因及突变 目的:本研究旨在利用全外显子组测序(WES)技术识别1个复发性流产(RPL)近亲婚配家系的致病基因及突变，为了解RPL的病理机制提供新的线索和依据。 材料与方法:本研究收集到1个珍贵的RPL近亲婚配家系，患者父母为表兄妹关系，无自然流产史，子代中3位女性均诊断为非综合征型RPL，遗传因素可能是导致该家系RPL发生的原因。选择该家系中的3名患者在Illunima的HiSeq2500平台进行全外显子组测序。对获得的全部WES数据进行过滤，保留3名患者共享的罕见纯合非同义变异。然后，通过进一步综合筛选和分析，鉴定出该RPL近亲婚配家系的最优候选致病基因及突变并在家系成员中进行基因型-疾病表型共分离分析。在另外264例无血缘关系RPL患者中，对候选基因编码区及两侧剪切位点进行Sanger测序，筛查罕见变异。 结果:系谱分析表明该RPL家系存在隐性遗传模式。对全部WES数据进行过滤后，共有6个3名患者共享的罕见纯合变异被保留。对这些基因及变异进行综合分析排序，CAPS(NM_004058.5: c.377delC，p.Leu127Trpfs)纯合无义突变可能是该RPL家系的致病基因及突变。Sanger测序确定3名患者均携带该位点的纯合变异，而他们的父母为杂合子携带者。该变异位点极为罕见并在物种间高度保守。我们在3名无血缘关系RPL患者中发现另外3个罕见的杂合变异但没能发现罕见纯合或复合杂合变异。 结论:我们的研究结果表明，常染色体纯合无义突变CAPSp.Leu127Trpfs，可能是导致RPL发生的母体致病基因及突变。 第二部分复发性流产中钙磷蛋白的生物学作用研究 目的:本研究旨在初步探索复发性流产中钙磷蛋白(CAPS)的生物学作用。 材料与方法:免疫荧光组织化学检测孕早期自愿终止妊娠患者流产蜕膜和绒毛组织中CAPS的表达和分布。荧光定量PCR(qPCR)检测CAPS在无血缘关系RPL患者和对照组蜕膜和胎盘绒毛组织中的表达。对于人子宫内膜上皮细胞RL95-2.:qPCR和Westernblot验证有效的CAPS特异性干扰RNA;qPCR检测分泌型磷蛋白1(SPP1)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达;ELISA检测培养上清中前列腺素E2(PGE2)的含量;Fluo-3，AM结合流式细胞术检测细胞内钙离子浓度。对于人胎盘绒毛膜癌细胞JAR:Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平。分离培养及免疫荧光鉴定人早孕期蜕膜腺上皮细胞，利用双重免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测CAPS的亚细胞定位，是否能够与内质网标记物PDIA3共定位。 结果:人早孕期蜕膜组织中CAPS仅表达于蜕膜腺上皮细胞;在绒毛组织中，CAPS仅表达于合体滋养细胞。与对照组相比，RPL患者的蜕膜和胎盘绒毛组织中CAPS表达下调。敲低CAPS表达可能促进子宫内膜容受性相关分子SPP1和MMP9的表达以及PGE2的释放，同时可以降低细胞内钙离子浓度。敲低CAPS表达，JAR细胞迁移和侵袭略有下降，对细胞凋亡无影响。人早孕期流产的原代蜕膜腺上皮细胞中CAPS能够与PDIA3共定位，提示CAPS在内质网有分布。 结论:CAPS在人早孕期蜕膜腺上皮细胞中特异性高表达，在内质网中有分布，其低表达可能通过降低蜕膜腺上皮细胞中钙离子浓度使子宫内膜容受性相关因子过度表达进而导致RPL发生。
复发性流产;CAPS基因;钙磷蛋白;钙离子;子宫内膜容受性
中国医学科学院北京协和医学院
博士
遗传学
王春林
2019
中文
R714.21
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）