遗传性肺动脉高压高通量药物筛选平台的建立
肺动脉高压是一种慢性进行性心血管疾病,通常以肺动脉压力升高、肺血管阻力增加(mPAP≥25mmHg、PAWP≤15mmHg、PVR>3WU)为主要特征,患者通常会因诱发右心衰竭而导致死亡。由于该病发病隐匿、发病初期无特异性症状,通常患者在被确诊时病情已经非常严重。其发病机制非常复杂,目前认为主要的病理学改变有肺血管重构,肺中小动脉壁中层平滑肌细胞增殖加快、内层内皮细胞出现功能损伤、新生内膜形成、内膜纤维化、丛状病变等。遗传性肺动脉高压属于肺动脉高压第一分类。目前发现导致肺动脉高压的突变基因有BMPRⅡ、BMPR1B、SMAD9、CAV1、KCNK3,其中BMPRⅡ突变所占比例最高,有70%~80%的家族性肺动脉高压均有BMPRⅡ突变。即使在特发性肺动脉高压患者中也有20%~40%的患者有BMPRⅡ突变。部分没有BMPRⅡ突变的病情严重的肺动脉高压患者也被发现出现BMPRⅡ表达量下降的情况。相比没有BMPRⅡ突变的患者,BMPRⅡ突变患者具有发病时间更早,病情更严重的特点。尽管近十年我国已引入一系列药物用于肺动脉高压的治疗,患者5年生存率有所提高,但是远期生存率仍然很低,而且目前临床应用的治疗药物价位高、患者需终生服药,这给社会和个人带来很大的负担。所以迫切需要创新药物的发现和新的药物筛选技术的介入。 本论文以遗传性肺动脉高压为研究对象,应用慢病毒介导的shRNA干扰方法成功的敲低了人动脉平滑肌细胞和人肺动脉内皮细胞的BMPRⅡ基因。分别对BMPRⅡ基因敲低后的人肺动脉平滑肌细胞和人肺动脉内皮细胞进行全转录组水平分析和表型分析,找到了适用于遗传性肺动脉高压高通量药物筛选的细胞模型。通过对敲低细胞和对照组细胞的差异表达基因进行KEGG通路分析,结果显示在top10信号通路里,两种细胞中均富集到以下和疾病相关的通路:细胞外基质受体相互作用信号通路、蛋白消化和吸收通路、黏附斑信号通路、PI3K-Akt信号通路。在肺动脉内皮细胞中,敲低细胞和对照组细胞的差异表达基因还富集到Ras信号通路。在肺动脉平滑肌细胞中,BMPRⅡ敲低后细胞增殖能力显著下降。而BMPRⅡ敲低的肺动脉内皮细胞发生了向间质细胞表型转变的过程endothelial-to-mesenchymaltransition(EndoMT),由内皮细胞特有的鹅卵石形态转变成类似于间质细胞的梭形。通过RT-qPCR检测基因表达量,结果显示BMPRⅡ基因敲低导致肺动脉内皮细胞的平滑肌细胞标志性基因αSMAmRNA水平表达量显著上调。EndoMT与肺动脉高压血管重塑密切相关,所以我们认为BMPRⅡ敲低的肺动脉内皮细胞更接近于疾病模型细胞。 本研究以构建的BMPRⅡ敲低的人肺动脉内皮细胞作为遗传性肺动脉高压疾病模型细胞,结合基于高通量测序的高通量药物筛选技术HTS2,建立了遗传性肺动脉高压的高通量药物筛选新方法。通过对2148个小分子化合物的筛选,找到一系列有潜在活性的小分子药物。值得一提的是在药物打分排名前30名药物中,有四个药物已有研究报道有益于肺动脉高压。药物打分排名前45名有超过12个小分子化合物的作用靶点已经报道过是肺动脉高压的潜在靶点,主要集中在Ras/Raf/MEK、RhoA/ROCK和PI3K/Akt通路。另外我们发现BMPRⅡ敲低的肺动脉内皮细胞在给予新型K-Ras选择性抑制剂6H05后αSMAmRNA水平的表达量明显下调,这说明6H05可能有逆转EndoMT的作用,可能成为治疗遗传性肺动脉高压候选小分子。研究数据显示了本研究建立的遗传性肺动脉高压药物筛选体系是可行的,这为遗传性肺动脉高压大规模药物筛选奠定了基础,也为遗传性肺动脉高压以及其它遗传性疾病的药物发现提供了新的研究思路。
遗传性肺动脉高压;BMPRⅡ;高通量药物筛选;αSMA;EndoMT
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生物化学与分子生物学
潘俊敏
2019
中文
R544.1
2020-06-15(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)