抗细胞因子主动免疫联合肿瘤免疫原性细胞死亡在小鼠乳腺癌模型中的干预
背景:细胞因子及相关细胞在疾病过程中构成了复杂的调控和效应网络，在正常生理状态下，细胞因子网络处于平衡和稳定的状态;而在病理状态下，某些细胞因子的缺失、功能受到抑制或者过表达并异常积累都会严重破坏了细胞因子网络稳态，影响机体免疫应答，导致严重疾病。目前，肿瘤免疫治疗研究的一个重要发展方向是针对肿瘤发生、发展中关键的病理性细胞因子及其信号通路，应用抗细胞因子及其受体的单克隆抗体或可溶性受体，或者细胞因子信号通路阻断剂进行针对肿瘤细胞生长、肿瘤血管生成及肿瘤免疫微环境的调控干预。本课题组前期研究显示，利用病毒样颗粒作为载体呈递细胞因子抗原表位，可诱导细胞因子特异的抗体产生，有效调控肿瘤免疫抑制微环境，促进抗肿瘤效应细胞的产生、向肿瘤组织聚集及其抗肿瘤效应的发挥，提示抗细胞因子主动免疫是有潜力的肿瘤免疫治疗有效策略。另一方面，近来研究发现，在治疗某些肿瘤时，如果使用一些特定化学药物(蒽环类药物)或通过放、射线治疗，肿瘤细胞不仅会发生凋亡，还会使肿瘤细胞从非免疫原性状态转化为具有免疫原性的状态，使机体产生抗肿瘤的免疫杀伤效应，此现象称为肿瘤免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)。ICD的发生伴随着很多信号分子的产生，免疫效应危险信号因子的合成与释放等。诱导肿瘤ICD可针对肿瘤细胞多重抗原激发较全面免疫应答、克服肿瘤异质性这一肿瘤疫苗免疫治疗中面临的关键障碍，是具有独特应用潜力的肿瘤免疫治疗新策略。 目的:本研究拟通过抗细胞因子主动免疫与肿瘤细胞免疫原性死亡诱导两个策略的联合干预，一方面利用抗细胞因子主动免疫对肿瘤免疫微环境进行调控，使其利于抗肿瘤效应细胞的产生及功能发挥;另一方面，利用特定的化疗药物诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，激发有效的抗肿瘤免疫效应细胞产生，通过两者协同，获得显著的肿瘤治疗效果，从而为临床肿瘤免疫治疗干预提供新的策略与手段。 方法:本研究基于前期实验基础，利用基因重组技术，获得以乙肝核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLP)为载体，分别呈递IL-33全分子及TGF-β1、FGF-2、IL-4、以及IL-13抗原肽的VLP疫苗。此外，筛选能够引起4T1肿瘤细胞免疫原性死亡的化疗药物。首先在荷瘤小鼠中经瘤内注射不同浓度的4种常用化疗药物，考察小鼠肿瘤生长、小鼠体重及存活情况，并考察关键的免疫原性分子表达，获得体内诱导肿瘤组织ICD的化疗药物种类及使用浓度;然后，在体外经肿瘤细胞实验，考察不同浓度、不同作用时间、不同药物引起肿瘤细胞死亡情况，并考察关键的免疫原性分子表达，从而获得体外诱导肿瘤细胞ICD的条件。之后，在4T1细胞移植小鼠乳腺癌模型中，以治疗性免疫策略进行抗细胞因子免疫干预，建立肿瘤后，持续监测小鼠肿瘤大小，待小鼠肿瘤大小至5-8mm时，用筛选出的化疗药物对小鼠进行瘤内注射治疗。在实验终点牺牲小鼠，以ELISA分析血清中特异性的IgG抗体水平;进行小鼠肿瘤称重;记录小鼠肺转移结节数目;以流式细胞术检测小鼠脾细胞中免疫效应细胞如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与免疫抑制细胞如调节性T细胞(Tregs)及骨髓来源免疫抑制细胞(MDSCs)的水平。 结果:经HPLC及电镜观察分析显示，本研究成功纯化制备了呈递IL-33全分子，及呈递TGF-β1、FGF-2、IL-4、与IL-13抗原肽的共5个病毒样颗粒疫苗，小鼠经VLPs免疫诱导了持续的、高水平的抗细胞因子特异抗体应答。通过荷瘤小鼠瘤内注射化疗药物实验，发现米托蒽醌(Mitoxantrone，MIT)、多柔比星(Doxorubicin，DOXO)、奥沙利铂(oxaliplatin，Oxa)和硼替佐米(bortezomib，Bort)4种常见化疗药物都具有4T1肿瘤杀伤活性，且具有剂量依赖性，但高浓度的化疗药可引起小鼠显著的体重下降及死亡率上升，而MIT和DOXO分别在0.8mg/kg/次和1.0mg/kg/次的瘤内注射剂量下对小鼠安全且具有杀瘤活性;同时，通过对肿瘤组织中的ICD关键分子ATP和HMGB1的检测，发现化疗药物瘤内注射后ATP和HMGB1的表达水平和对照组相比都有所升高，说明化疗药物瘤内注射可引起肿瘤组织ICD。进一步通过肿瘤细胞体外实验，证实MIT和DOXO在10μM浓度下，作用12小时后，即可引起明显的肿瘤细胞凋亡及ICD关键分子钙网蛋白CRT、ATP、HMGB1的表达。随后，经MIT和DOXO处理的ICD肿瘤细胞以预防性及治疗性方式免疫小鼠，对接种的肿瘤细胞生长及转移产生了显著抑制，进一步显示ICD细胞诱导成功及其可在体内激发抗肿瘤免疫。在体内诱导肿瘤组织ICD与不同的抗细胞因子病毒样颗粒免疫协同干预研究中，相较于载体对照组，肿瘤大小有一定程度抑制;待小鼠肿瘤大小为5-8mm时，进一步用MIT和DOXO对小鼠进行瘤内注射治疗，MIT和DOXO单独干预的小鼠肿瘤生长获得明显抑制，而相比于单独的瘤内注射药物及抗细胞因子免疫组，联合干预小鼠乳腺原位肿瘤生长及肺转移受到了更为显著的抑制。此外，抗TGF-β1组脾脏和肿瘤淋巴细胞中CD8α+数量显著上升。 结论:本研究通过创新性的将抗细胞因子主动免疫与肿瘤免疫原性细胞死亡诱导两个策略进行联合，同时考虑肿瘤免疫微环境调控及抗肿瘤免疫效应细胞诱导，获得了对肿瘤生长的协同抑制作用，为临床肿瘤免疫干预提供了新的策略与手段，也为开发新型的肿瘤疫苗提供了新的思路。
乳腺癌;病毒样颗粒;抗细胞因子主动免疫;肿瘤免疫原性细胞死亡;联合治疗
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生物化学与分子生物学
马雁冰
2019
中文
R737.9
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）