泛发性脓疱型银屑病的转录组学及炎症因子变化的研究
背景及研究目的 泛发性脓疱型银屑病(Generalized Pustular Psoriasis，GPP)是一种罕见的、周期性发作的炎症性皮肤疾病，临床上表现为出现在红斑或正常皮肤上的急性或亚急性全身性无菌脓疱。GPP可以累及多个系统，严重时可危及生命。GPP最常见于中年人，也可发生于儿童。目前，GPP的发病机制仍不清楚，治疗方法仍未达成共识，因此亟需开展深入研究。本课题拟对GPP病人在不同时期外周血中基因及炎症因子蛋白的表达变化情况进行系统研究，以期发现关键基因及调控通路，为新的GPP的治疗靶点的发现提供线索和依据。 研究方法 1.招募5名GPP患者，在其初次确诊时入组并进行了长达6个月的阿维A治疗与观察。在GPP患者脓疱期(治疗前)，脓疱消退期(治疗后2周)和稳定期(治疗维持6个月)三个时间点进行了外周血采样;利用RNA测序(RNA Sequencing，RNA-Seq)方法对这些患者外周单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的转录组进行分析;通过实时定量PCR实验对RNA-Seq分析结果进行验证;利用统计学方法对测序数据进行处理，获得治疗前后不同时间点的差异表达基因，利用Metascape及IngenuityPathwayAnalysis等方法进行数据挖掘及生物信息学分析，构建差异基因调控网络，分析关键基因及调控通路。 2.收集28名健康对照者及24名GPP患者脓疱期的血清，利用液相芯片技术对所收集血清中的27种细胞因子进行了定量分析，在此基础上，利用多元统计学方法，对健康对照与GPP患者血清中的细胞因子表达差异进行了主成分分析及聚类分析;收集12名GPP住院患者治疗前(第0期)、治疗后2周(第1期)及治疗后6周(第2期)这三个时间点的血清，并利用液相芯片对所收集血清中的27种细胞因子进行了定量分析，在此基础上，利用统计学方法分析了细胞因子表达水平与GPP的严重程度的相关性。 结果 RNA-Seq结果显示患者在接受药物治疗后PBMC的基因表达发生了显著改变，利用实时定量PCR方法对部分基因表达进行检测表明RNA-Seq的分析准确有效。差异表达基因分析显示银屑病相关的特征性炎症基因如CXC1、CXCL8(IL-8)、S100A8、S100A9、S100A12和LCN2在GPP患者好转后表达明显下调。功能富集和注释分析显示部分差异表达基因集合与白细胞尤其是中性粒细胞功能相关。通路分析显示多种促炎通路包括IL-1、IL-6、IL-17A及IFN等信号通路在患者疾病缓解时表达受到抑制;此外，天然免疫调控相关基因，如TLR1、TLR5、TLR8、MYD88、NLRC4、NLRC5、NOD2和IRF7等基因的表达在疾病缓解后显著下调。分析表明，PLK介导的有丝分裂作用通路及细胞周期通路的相关基因也在治疗后发生了显著下调。通过建立调控因子网络，发现GPP转归相关的基因调控网络的上游信号分子为IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-21、IL-5、IL-17A、TNF、OSM等。 液相芯片分析结果表明，与健康对照组细胞因子分泌水平比较，GPP患者脓疱期血清中IL-1β(p＜0.001)、IL-1Ra(p＜0.001)、IL-4(p＜0.001)、IL-5(p＜0.001)、IL-6(p＜0.001)、IL-7(p＜0.001)、IL-8(p=0.006)、IL-10(p＜0.001)、IL-12(p70)((p＜0.001)、IL-13(p＜0.05)、IL-17(p＜0.001)、G-CSF(p＜0.001)、IFN-γ(p＜0.001)、IP-10(p=0.002)、MCP-1(p=0.001)、TNF-α(p＜0.001)和VEGF(p＜0.001)均较健康对照显著升高，IL-2、IL-15、FGF-basic，GM-CSF和PDGF-bb在两者中无明显区别，Eotaxin(p=0.03)的表达低于健康对照，提示脓疱期患者的免疫系统受到强烈激活;相关性分析发现IL-6、G-CSF、IL-8、IFN-γ、IL1-Ra、IL-10、IL-13和IL-1β等因子与GPP的严重程度显著相关(r＞0.4，p＜0.001)。对治疗不同时期的GPP患者血清中的细胞因子进行分析表明，IL-6、IL-7、IL-12、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10、IL-13、G-CSF和IP-10的表达水平在治疗后下降(p＜0.05)，其中IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IP-10的水平下降到了正常水平。IL-5、MCP-1、IL-9、IL-17、Eotaxin、TNF-α和VEGF的表达水平在治疗后无明显变化。在表达发生变化的细胞因子中，IL-6的表达与疾病严重程度高度相关(r=0.683，p＜0.0001)，并且是唯一与病人高热相关的细胞因子;此外，血清中的IL-6的表达水平在治疗后迅速降至正常。 结论 本研究通过对GPP患者临床样本进行RNA-Seq及液相蛋白芯片等系统生物学手段进行分析，首次发现在患者外周血中，大量的免疫调控基因及炎症因子蛋白的表达发生变化，证实GPP的发病与机体系统性的免疫失衡相关。在此基础上，构建了GPP病理过程中的基因调控网络，发现了IL-6、IL-1β、IFN-γ等因子为炎症驱动因子，并发现天然免疫反应、细胞周期调控等通路的基因表达失调与GPP的发病及转归有密切关联。此外，发现IL-6可能是GPP发病及预后相关的有效临床标志物。本研究展示了系统生物学方法在炎症性疾病研究中的功能和价值，研究结果中发现的新的通路和生物标记物可能为理解GPP的致病机制和寻找新的治疗方法提供思路。
脓疱型银屑病;中性粒细胞;炎症因子;生物信息学;转录组学
中国医学科学院北京协和医学院
博士
皮肤病与性病学
晋红中
2019
中文
R758.63
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）