甲醇致恒河猴认知障碍模型的建立与相关机制研究
背景认知障碍是脑疾病中诊治最困难的疾病之一，阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是老年人最常见的以认知功能障碍为主要表现的神经退行性疾病。近年来研究发现，长期暴露于浓度超标的甲醛环境，会损伤人的学习记忆、情感认知等功能，也有报道称AD病人和小鼠模型尿液和脑组织中内源性甲醛含量均升高。甲醇是一种毒性物质，有研究认为它在体内发挥毒性主要通过中间代谢产物甲醛，低浓度甲醇慢性喂养恒河猴，可以引起认知障碍和磷酸化tau蛋白的增多。但甲醇/内源性甲醛引起认知损伤的机制尚不确定，对于甲醇慢性暴露造成的机体损伤尚无研究全面阐述。本课题拟通过体外实验探讨甲醛对神经细胞的损伤作用，通过体内恒河猴实验建立认知障碍模型，并分析其机制及甲醇慢性暴露对机体的影响。 方法在体外细胞水平，将SH-SY5Y神经瘤细胞暴露于不同浓度的甲醛。采用细胞划痕实验、细胞活性实验检测细胞迁移、形态、活性和增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;透射电镜观察超微结构改变;多因子检测技术检测细胞上清炎性因子;WesternBlotting检测细胞内磷酸化tau蛋白、Aβ及线粒体分裂相关蛋白的表达。 在体内动物水平，将3-6岁、雄性恒河猴分为实验组和对照组，每组6只，实验组给予低浓度甲醇自由饮用，对照组给普通饮水。处理不同时间进行可变空间延迟反应任务、物体识别实验、取物实验以及Viewpoint等行为学检测;采集动物的脑脊液、血液、尿液、粪便，进行血常规、尿常规、血生化等检测，通过HPLC检测尿液中甲醛含量;甲醇处理3个月、9个月时取脑、肝、肾、胃肠等脏器进行病理学及分子生物学检测;多因子检测技术检测血清、脑脊液及脑组织的炎性细胞因子水平。最后，通过16SrRNA高通量测序技术比较不同组恒河猴肠道菌群丰度及构成的差异，通过LC-MS技术对恒河猴尿液代谢组学进行研究。 结果0.05mM甲醛即可抑制细胞迁移，0.1mM作用4小时即可降低细胞活性和增殖能力，与甲醛剂量和作用时间呈正相关;甲醛可以诱导神经细胞凋亡，增加线粒体分裂，使超微结构损伤，上调tau蛋白的磷酸化水平。 长期饮用低浓度甲醇可以导致恒河猴认知功能障碍。在病理学方面，大脑轻度萎缩，Aβ阳性斑块增多，磷酸化tau蛋白表达量升高，神经突触显著丢失、神经元数量减少，伴胶质细胞增多，以上改变均与尿液甲醛水平呈正相关。甲醇/内源性甲醛可导致恒河猴肝脏、肾脏、及胃肠道慢性损伤;脑组织、肝脏线粒体超微结构受损明显;可上调自噬相关蛋白和线粒体裂解相关蛋白的表达;另外，甲醇/内源性甲醛可以破坏肠道菌群结构，诱发Firmicutes/Bacteroidetes比例失衡及代谢紊乱。 结论本研究发现甲醛可以通过抑制迁移，降低生存活性，增加线粒体裂解，促进凋亡等多种途径对神经细胞造成损伤，显著上调神经细胞tau蛋白的磷酸化水平;内源性甲醛通过增强自噬和依赖线粒体的凋亡途径损伤神经系统;可以导致恒河猴认知障碍，具有Aβ阳性斑块和磷酸化tau蛋白增多、神经元减少、突触丢失、胶质细胞增生等AD样病理特征。甲醇/内源性甲醛对机体肝肾及胃肠道会产生慢性损伤，可破坏肠粘膜屏障结构，使肠道菌群失调;同时使恒河猴代谢紊乱，谷氨酸代谢通路异常可能参与了甲醇/内源性甲醛导致的认知障碍。
阿尔茨海默病;内源性甲醛;动物模型;肠道菌群;代谢组学
中国医学科学院北京协和医学院
博士
病理学与病理生理学
秦川
2019
中文
R749.1
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）