肠道共生菌群改变引起Th细胞的偏向对CA16感染恒河猴的影响
目的建立一种可以用于共生菌群研究的恒河猴动物模型，并对肠道共生菌群改变后机体免疫系统中T淋巴细胞亚群的变化与柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)感染进程和病理学变化之间的关系进行研究。 方法本研究联合使用氨基糖苷类、青霉素类、糖肽类和硝基咪唑类等4类广谱抗生素，通过饲喂联合抗生素的方法来构建共生菌群被清除的灵长类动物模型;应用实时荧光定量PCR技术和扩增子测序技术相结合的方法检测肠道和呼吸道共生菌群多样性和丰富度，同时应用宏病毒组测序和代谢组学方法来分析机体微生物代谢产物和共生病毒组成的改变;在CA16感染后，观察恒河猴出现的发热、手足口疱疹等临床症状;RT-qPCR检测病毒血症和各组织器官中的病毒载量;H&E染色观察抗生素处理后和感染后各组织器官的病理变化;并通过流式细胞术、液相芯片技术、表达谱芯片和免疫荧光等方法对恒河猴机体免疫系统变化和CA16感染进行检测和观察。 结果本研究按实验设计分为两个部分。在第一部分建立动物模型的研究中，根据实时荧光定量PCR结果，在饲喂抗生素后第9天总16SrRNA基因相对丰度下降80％以上，随后菌群丰度保持着相对较低的水平。根据肠道菌群扩增子测序结果，抗生素处理后第9天恒河猴肠道共生菌OTU水平下降90％以上，14天后检测到肠道优势菌转变为埃希氏菌-志贺菌，该物种组成能够长期保持稳定。重塑后的肠道菌群丰度较低，且没有观察到对机体健康有有害的影响。根据呼吸道共生菌群测序结果，抗生素处理后恒河猴呼吸道共生菌群在属分类水平上的优势菌群组成和结构有所改变，但仍具有丰富的呼吸道菌群和菌群多样性。此外，肠道病毒组和代谢组的检测结果表明，随着肠道共生菌群的清除病毒组中噬菌体和DNA病毒丰富度显著下降，因此病毒组丰度与共生菌群多样性之间存在着正相关的关系;原有的肠道菌群代谢产物在抗生素处理之后色氨酸等代谢产物显著减少，而鸟氨酸、甘露醇、苏糖醇、糖胺聚糖等代谢产物水平显著增高。外周免疫细胞的检测结果表明抗生素处理后恒河猴外周血中T淋巴细胞比例显著升高，B淋巴细胞比例下降;对抗生素处理恒河猴的PBMCs进行表达谱分析结果则表明，IL13、VCAM1和IL1基因表达水平上调了5倍以上，其他固有免疫相关基因的表达水平也有着显著变化。在第二部分肠道共生菌与CA16感染之间的相互作用关系研究中，肠道共生菌群缺失的恒河猴与正常恒河猴一样均可以被CA16感染，并在感染后3～4天出现体温升高、手口部位疱疹等临床症状;肠道共生菌群缺失的恒河猴在感染后第3天检测出病毒血症，而正常恒河猴在感染后第5天检测出病毒血症，且肠道共生菌群缺失的恒河猴病毒血症持续时间更长、病毒载量峰值更高;肠道共生菌群缺失恒河猴各主要组织中病毒载量峰值出现的时间更晚、峰值更高且清除时间更久，病理变化也更严重。在CA16感染后，肠道共生菌群缺失恒河猴没有产生有效的中和抗体水平，且分泌IgG的B细胞水平也低于正常恒河猴。免疫荧光结果也验证了肠道共生菌群缺失恒河猴CD3+T淋巴细胞和感染后的病毒颗粒在小肠组织中的数量更多。CA16感染后外周免疫细胞和细胞因子的检测结果表明，在肠道共生菌群缺失恒河猴中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例高于正常水平，CD8+和CD20+淋巴细胞应答水平在CA16感染早期则低于正常恒河猴，CD3+CD4+IFNγ+淋巴细胞比例也明显下降;Th17/Treg细胞比例和IL17A细胞因子水平也有所改变;CD3+CD4+GATA3+淋巴细胞比例及其分泌的多种细胞因子水平在感染中后期大幅度升高。CA16感染后抗生素处理组恒河猴的组织局部免疫与正常恒河猴相比，小肠中CD3+CD4+IL17A+、CD3+CD4+GATA3+淋巴细胞比例增加，而CD3+CD4+IFNγ+淋巴细胞比例减少，CD4+CD25+淋巴细胞比例两组的差异不大。 结论本研究的结果表明在不影响机体健康状态的前提下，短期饲喂高剂量联合抗生素后即能有效清除恒河猴肠道共生菌，达到建立可用于肠道共生菌群研究的恒河猴动物模型的目的;同时，恒河猴肠道共生菌群的缺失会影响菌群代谢产物水平、机体肠道病毒组组成和外周血中淋巴细胞水平。应用CA16病毒感染动物模型，肠道共生菌群缺失的恒河猴与正常恒河猴一样均可以被感染并出现临床症状;但与正常恒河猴相比，肠道共生菌群缺失恒河猴在感染后的病毒血症和组织中病毒载量情况更严重且清除时间更久。与机体免疫系统变化进行比较分析，我们发现肠道共生菌群缺失恒河猴的全身和局部免疫系统中Th17/Treg细胞比例失衡、Th2细胞比例增多及其分泌的多种细胞因子水平上调，这些T细胞亚群比例的失衡和偏向性可能会加重机体炎性反应、影响CD8+T淋巴细胞应答和B细胞分化及抗体的产生，进而导致CA16持续性感染并加重病理损伤。总的来说，本研究证实了恒河猴肠道共生菌群的改变可能会通过调节机体Th2/Th1、Th17/Treg细胞比例的平衡来影响CA16感染的进程和病理变化。
柯萨奇病毒A组16型;肠道共生菌;Th细胞;免疫反应;动物模型
中国医学科学院北京协和医学院
博士
免疫学
刘龙丁
2019
中文
R392
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）