Ubqln4在细胞有丝分裂期的功能和长链非编码RNA SNHG6在胃癌的作用机制研究
第一部分Ubqln4在细胞有丝分裂期的功能研究 细胞有丝分裂是一个复杂但有序精巧的过程。细胞通过有丝分裂将其携带的遗传信息准确传递给子代细胞。真核细胞中有多种蛋白质翻译后修饰类型，常见的包括泛素化、磷酸化与去磷酸化、糖基化与去糖基化等。翻译后修饰可以通过引起蛋白质在结构、活性及细胞定位等方面的改变参与到细胞内几乎每一项生命活动中。在众多翻译后修饰中，磷酸化修饰是研究最为广泛的。围绕着细胞周期相关蛋白的一系列磷酸化和去磷酸化事件构成了细胞周期调控的磷酸化网络。 Ubqln4，又名AlUp，是Ubiquilins(Ubqlns)蛋白家族成员。Ubqlns蛋白家族在蛋白结构上具有两个重要的结构域:即氨基端的可以和蛋白酶体结合的泛素样结构域(Ubiquitin-like UbL)、羧基端的可以与泛素分子结合的泛素相关结构域(ubiquitin-associate UBA)。借助这两个结构域，Ubqlns蛋白可以作为一个穿梭转运体，将特定的泛素化修饰后的底物蛋白转运至蛋白酶体。最新的研究揭示，Ubqln4可以被ATM磷酸化，并将泛素化的MRE11蛋白从受损的染色体上去除，从而参与同源重组介导的DNA损伤修复的早期步骤。目前关于Ubqln4基因功能的研究较少。 我们证实Ubqln4可以诱导胃癌细胞周期阻滞及衰老，为了进一步明确Ubqln4的作用机制，我们通过免疫沉淀联合质谱分析鉴定Ubqln4在细胞内的相互作用蛋白。对质谱鉴定到的329个蛋白进行功能注释分析显示，Ubqln4的潜在互作蛋白集中在核糖体通路、系统性红斑狼疮信号通路、蛋白酶体通路及内质网蛋白加工信号通路等。我们还证实Ubqln4可以负向调控p21的E3连接酶RNF114，并通过此作用促进p21蛋白在胃癌细胞的积累，进而介导Ubqln4在胃癌细胞的抑癌作用。 Ubqln4可以诱导胃癌细胞发生周期阻滞，但是具体的机制未探讨明确。基于此，我们通过细胞周期同步化分离各周期时相的细胞，检测Ubqln4表达水平的变化。我们发现Ubqln4在有丝分裂期的电泳条带迁移率低于其他细胞周期时相。我们进一步通过免疫沉淀纯化有丝分裂期的Ubqln4蛋白，通过Westernblot检测丝氨酸/苏氨酸磷酸化显示，Ubqln4在有丝分裂期的电泳迁移率降低是由于发生磷酸化修饰引起。细胞周期同步化处理结合Westernblot证实，Ubqln4的磷酸化修饰随着有丝分裂期的开始而出现，伴着有丝分裂期的结束而消失。激酶抑制剂筛选结合体外激酶实验证实，Ubqln4在有丝分裂期的磷酸化修饰依赖于激酶CDK1-CyclinB，并且Ubqln4与细胞周期激酶PLK1存在相互作用。蛋白半衰期检测及泛素化实验证实Ubqln4促进PLK1与泛素结合，进而通过蛋白酶体途径降解并且Ubqln4与PLK1的相互作用依赖于其UBA结构域与STI1-2结构域。为了找寻Ubqln4磷酸化修饰的位点，我们利用细胞周期同步化-免疫沉淀-质谱分析流程，结合Ubqln4蛋白截短体区域筛选，初步将Ubqln4的磷酸化位点锁定在133-160位氨基酸内的总计11个丝氨酸/苏氨酸上。为了明确Ubqln4对细胞周期的影响，我们构建RFP-H2B-HeLa细胞系作为工具细胞，并通过Time-Lapse活细胞实时监测细胞周期进程的实验方案，证实Ubqln4可以延长细胞有丝分裂时长并影响细胞出有丝分裂期。 综上，我们阐明了Ubqln4在胃癌细胞调控p21的具体机制，首次发现了Ubqln4在细胞有丝分裂期的磷酸化现象，并证实CDK1是介导其磷酸化修饰的激酶;发现了Ubqln4对PLK1蛋白酶体降解途径的调控以及Ubqln4对细胞周期的影响，本文的研究为揭示Ubqln4在细胞周期方面的生物学作用打下了良好的基础，对后续Ubqln4基因功能的深入研究具有重要意义。 关键词:Ubqln4;细胞周期;磷酸化;CDK1;PLK1;蛋白酶体途径 第二部分长链非编码RNASNHG6在胃癌中的作用及机制研究 胃癌是人类常见癌症之一，在2018年，全球预计有103万例新增胃癌病例及78万例死亡病例，分别占新增癌症病例的5.7％、癌症死亡病例的8.2％，其发病率和死亡率分别位居全部癌症的第六位和第五位。有近半数的新发病例和超过半数的死亡病例发生在亚洲。越来越多的LncRNAs相关的功能研究显示，LncRNAs在胃癌发生发展的基因调控网络中具有重要作用，LncRNAs可以参与肿瘤增殖、侵袭转移等众多过程。 SNHG6，也称为U87HG，最早是由leichang等人在肝癌组织中测序得到并发现其在肝癌组织中表达量高于癌旁正常组织，其表达水平与肝癌患者的临床分期、门静脉肿瘤血栓密切相关。SNHG6可以作为潜在的致癌基因在肝癌的增殖与耐药等方面发挥作用。然而，SNHG6在其他肿瘤发生中的作用机制并不清晰。在本研究中，我们首先通过对公共数据库Oncomine的数据分析发现，SNHG6在胃癌组织中的表达水平高于其在胃正常组织中的表达水平。我们利用胃癌患者临床血清样本对SNHG6的表达水平进行验证，发现胃癌患者血清样本中SNHG6的表达水平显著高于其在正常健康人群血清样本中的表达。我们对五种胃癌细胞系及胃黏膜永生化细胞中SNHG6的表达水平进行检测，结果显示SNHG6在胃癌细胞中也呈现高表达。我们分别选取高表达SNHG6的胃癌细胞系(MGC-803及MKN45)与低表达SNHG6的胃癌细胞系(SGC-7901)，通过慢病毒感染在体外成功构建敲降SNHG6和过表达SNHG6的胃癌细胞系。通过CCK-8与克隆形成实验检测敲降/过表达SNHG6对胃癌细胞增殖活性与克隆形成能力的影响，结果显示，敲降SNHG6可以显著抑制胃癌细胞的体外增殖能力与克隆形成能力，反之，过表达SNHG6可以促进胃癌细胞的增殖能力与克隆形成能力;我们进一步通过裸鼠皮下成瘤实验检测敲降SNHG6后胃癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的改变，结果显示，敲降SNHG6的胃癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力显著低于对照细胞。SAβ-gal染色显示，敲降SNHG6可以诱导胃癌细胞发生衰老。qPCR及Westernblot实验证实，敲降SNHG6可以促进p21的mRNA水平和蛋白水平表达升高。我们进一步通过Westernblot实验发现，敲降SNHG6可以激活ERK1/2，JNK及p38信号通路并且抑制EZH2的表达。EZH2对p21的转录具有抑制作用。我们分别利用ERK1/2，JNK及p38通路抑制剂处理SNHG6敲降的胃癌细胞发现:抑制JNK通路几乎阻断了SNHG6敲降所引发的p21蛋白的积累;抑制p38途径并未影响SNHG6敲降所引起的p21的变化;ERK途径的阻断产生了与JNK途径阻断后相反的效果。在SNHG6对p21的调控方面，JNK通路的激活可能占主导地位。 综上所述，我们的研究提示SNHG6可能通过影响胃癌细胞的增殖、衰老过程而在胃癌发生发展相关的基因调控网络中扮演一定角色，研究初步提示了SNHG6与p21的调控关系，为SNHG6更深入的机制研究奠定了一定的基础。
胃癌;Ubqln4蛋白;细胞增殖;长链非编码
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生物化学与分子生物学
黄常志
2019
中文
R735.2
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）