Wip1在结直肠癌发生发展过程中的调控机制研究
研究背景 目前研究显示Wip1在多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中高表达，但Wip1在结直肠癌中的表达情况及Wip1对结直肠细胞生物学行为的影响及机制尚不清楚。 研究目的 明确Wip1在结直肠癌组织及正常组织中的表达情况，分析Wip1表达与临床病理间的关系。初步探讨Wip1对结直肠癌细胞活性、增殖、侵袭与迁移的影响及机制。 研究方法 (1)采用RealtimePCR法检测Wip1mRNA在35对新鲜结直肠癌组织及对应正常组织中的表达情况; (2)采用Westernblot法检测Wip1蛋白在35对新鲜结直肠癌组织及对应正常组织中的表达情况; (3)采用免疫组化法检测Wip1蛋白在100对结直肠癌组织及对应正常组织中的阳性表达情况，并根据表达情况分组，探讨与临床病理之间的关系。 (4)在LoVo、HT29、HCT116、DLD1、RKO、SW4806种细胞株中筛选Wip1表达最高的2种细胞系;分析数据库数据，寻找在结直肠癌中高表达且与Wip1相关的基因; (5)在筛选出的细胞系中，采用RNAi及质粒转染方法构建敲降Wip1表达及过表达上述基因的细胞株; (6)MTT法、克隆形成法、Transwell法、细胞划痕法检测不同细胞株的活性、增殖、侵袭及迁移能力; (7)初步探讨Wip1影响上述生物学行为的机制。 研究结果 (1)RealtimePCR法结果显示，Wip1mRNA在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织中的表达水平(p=0.002)，且T3+T4期中的表达水平明显高于T1+T2期中的表达水平(p＜0.001)，有淋巴结转移组表达水平高于无淋巴结转移组水平(p＜0.001); (2)Westernblot法结果显示，Wip1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织中的表达水平(p＜0.001); (3)免疫组化法结果显示，Wip1阳性表达主要位于细胞浆内，结直肠癌组织中Wip1阳性表达分级及阳性评分均高于正常组织，差异有统计学意义。Wip1高表达与术前CEA≥5ng/ml(p＜0.001)、大体分型为溃疡型(p=0.030)、分化程度低(p=0.007)、T分期晚(p=0.010)、伴淋巴结转移(p＜0.001)、pTNM分期晚(p＜0.001)、伴脉管瘤栓(p=0.005)、伴神经侵犯(p=0.001)等因素密切相关。 (4)HCT116、LoVo为2种Wip1表达最高的细胞系;成功筛选在结直肠癌中高表达且与Wip1相关的癌基因KPNA2; (5)成功构建HCT116si-Wip1+NC、LoVosi-Wip1+NC、HCT116si-NC+KPNA2、LoVosi-NC+KPNA2、HCT116si-Wip1+KPNA2、LoVosi-Wip1+KPNA2、HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC细胞株; (6)MTT法、克隆形成法、Transwell法、细胞划痕法显示HCT116si-Wip1+NC、LoVosi-Wip1+NC相较于HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC活性、增殖、侵袭及迁移能力减弱，差异有统计学意义(p＜0.05);HCT116si-NC+KPNA2、LoVosi-NC+KPNA2相较于HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC上述能力均增强，差异有统计学差异(p＜0.05);HCT116si-Wip1+KPNA2、LoVosi-Wip1+KPNA2可一定程度上逆转敲降Wip1导致的上述能力降低; (7)Westernblot法显示，敲降Wip1表达，导致p-AKT表达降低，而p-GSK-3β表达升高，与过表达KPNA2结果相反;RealtimePCR法结果显示，结直肠癌组织中TwistmRNA表达明显高于正常组织，差异有统计学意义(p＜0.05)，与Wip1mRNA、KPNA2mRNA表达均具有正相关关系;而E-cadmRNA在结直肠癌组织中的表达明显低于正常组织，差异有统计学意义，与Wip1mRNA、KPNA2mRNA表达均具有负相关关系(p＜0.05)。 研究结论 (1)Wip1mRNA及Wip1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平均高于在正常组织中的表达水平，差异有统计学意义;Wip1蛋白高表达与分化程度差、pTNM分期晚、伴有脉管瘤栓及神经侵犯等指标密切相关。 (2)敲降Wip1表达可显著降低结直肠癌细胞株的活性、增殖、侵袭及迁移能力，而再过表达KPNA2后，可一定程度地逆转上述结果。Wip1可能通过KPNA2活化AKT/GSK-3β信号通路、上调转移相关蛋白Twist表达等途径影响结直肠癌发生发展、侵袭转移。
结直肠癌;Wip1;临床病理;细胞活性
中国医学科学院北京协和医学院
博士
肿瘤学（专业型）
周志祥
2019
中文
R735.37
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）