司坦唑醇与达那唑在再生障碍性贫血中的应用比较及机制探索
第一部分 研究目的:司坦唑醇和达那唑分别为国内外最广泛应用的雄激素类药物，目前尚无二者在再生障碍性贫血(AA)中的应用比较数据。我们拟设计回顾性临床研究比较司坦唑醇和达那唑治疗获得性NSAA的疗效并探索其对患者调节性T细胞的影响。 研究方法:回顾性分析自2017.1至2019.1于北京协和医院采用CsA单药、CsA联合司坦唑醇和CsA联合达那唑治疗的获得性NSAA患者临床资料，比较不同治疗方案的疗效及安全性。采用流式细胞术检测患者治疗前及治疗半年后CD4+CD25+foxp3+Treg细胞，观察不同治疗方案对患者Treg细胞的影响。 研究结果:本研究共纳入74例确诊NSAA患者，其中，接受CsA联合司坦唑醇治疗者40例(54.1％)，CsA联合达那唑治疗者14(18.9％)例，CsA单药治疗者20(27％)例，三组患者基线特征对照无统计学差异。至随访截止，所有患者均经历了至少半年的治疗。其中，CsA联合司坦唑醇组患者总反应率(ORR)为70％，明显高于单药CsA组患者(70％vs.40％，P=0.025)，CsA联合达那唑组患者ORR较单药CsA组患者无显著差异，分别为57.2％vs.40％(P=0.324)。三组患者完全缓解率(CRR)分别为30％、28.6％、10％，两两比较无统计学差异。CsA联合司坦唑醇组患者红系治疗反应明显高于CsA联合达那唑组患者(60％vs.28.6％，P=0.043)，而CsA联合达那唑组患者巨核系治疗反应较CsA联合司坦唑醇组稍高，但差异无统计学意义(57.1％vs.45％，P=0.434)。两组患者粒系治疗反应相当(55％ vs.57.1)。三种不同治疗方案中位起效时间分别为3(1-8)、2.5(2-6.5)、3.25(1.5-5.5)月，两两比较无统计学差异。最常见的不良反应为肾功能异常，发生于44.6％(33/74)的患者中，其中，2例(2.7％)患者因重度肾功能不全停药。肝功能异常发生于约20％患者中，其中，ALT增高者占16.2％(12/74)，胆红素增高者占18.9％(14/74)，均为轻中度增高，经对症治疗后好转。其他少见不良反应包括女性月经紊乱、胃肠道反应、毛发增多等，发生率均不足20％。相较于单药CsA，联合司坦唑醇或达那唑治疗未显著增加患者不良反应发生率。74例患者中，19例患者进行了治疗前后Treg细胞检测，其治疗前Treg细胞比例显著低于正常对照者，分别为2.7％vs.4.7％(P=0.01)。CsA联合司坦唑醇治疗后，患者Treg细胞水平显著增加(n=12，P=0.02)，4例经CsA联合达那唑治疗的患者治疗后Treg细胞比例增加，但无显著统计学差异，考虑与样本量较小有关，而3例经CsA单药治疗的患者均出现了Treg细胞比例下降(P＞0.05)。 研究结论:司坦唑醇在NSAA中的治疗作用不亚于达那唑，且其在促进患者红系治疗反应中存在优势，二者均未显著增加患者不良反应发生率。NSAA患者外周血中Treg细胞比例显著低于健康对照者，而相较于单药CsA，联合司坦唑醇或达那唑治疗后患者Treg细胞呈上调趋势，提示司坦唑醇和达那唑可能有免疫调节作用。 关键词:再生障碍性贫血;司坦唑醇;达那唑;调节性T细胞 第二部分 研究目的:雄激素促造血机制尚未完全阐明。早期观点认为其可能是通过EPO发挥间接促红系造血作用，近年研究认为其可能有免疫调节作用。本研究拟探索司坦唑醇和达那唑在再生障碍性贫血(AA)中的促造血及免疫调节作用。 研究方法:1.体外研究:以人慢性粒细胞白血病细胞株K562为体外造血分化模型，通过流式细胞术检测细胞膜表面CD235a或CD41表达及通过联苯胺染色两种方法探索司坦唑醇和达那唑体外促红系及巨核系分化作用。并收集初治获得性AA患者及健康志愿者(各10例)骨髓单个核细胞进行体外集落培养，比较司坦唑醇或达那唑作用后骨髓集落生长情况。2.动物实验:建立免疫介导的AA小鼠模型，随机分为四组(n=5)，自建模日起分别给予CsA单药、CsA+司坦唑醇、CsA+达那唑、空白对照治疗，治疗周期为30天。治疗期间每周监测小鼠血常规，治疗结束后行骨髓集落培养、外周血T细胞亚群、炎症因子、EPO、TPO等检测，并采用westernblot法检测小鼠骨髓前体细胞EPO受体(EPOR)表达。 研究结果:1.体外研究:司坦唑醇或达那唑作用72h后，流式细胞术检测细胞膜表面CD235a或CD41表达较阴性对照无显著差异，药物作用后24h、48h、72h、96h联苯胺染色阳性细胞率均较阴性对照无差异，并显著低于阳性对照(P＜0.05)。10例NSAA患者BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM集落数均显著低于健康对照者(P＜0.05)，司坦唑醇和达那唑作用后AA患者及健康对照者骨髓集落数均无明显增加。2.动物实验:建模后1周，实验小鼠出现明显血细胞减少，无药物干预下均于15天内死亡。给予上述不同药物治疗后14天，各组小鼠血细胞呈现不同程度恢复。虽然CsA联合达那唑治疗组小鼠血小板恢复速度明显快于CsA联合司坦唑醇组，但治疗后28天两组小鼠PLT计数无差异。而CsA联合司坦唑醇组小鼠第28天血红蛋白水平显著高于CsA联合达那唑组(P＜0.05)。联合雄激素治疗组小鼠各时间点血细胞均不同程度高于单药CsA组。相较于CsA单药组，CsA联合司坦唑醇治疗组小鼠骨髓BFU-E产出增加(P＜0.05)，而CsA联合达那唑治疗组小鼠CFU-GM产出增加(P＜0.05)。CsA联合司坦唑醇组和CsA联合达那唑组小鼠BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM集落数无显著差异。流式细胞术检测小鼠外周血T细胞亚群显示建模后未治疗AA小鼠存在明显CD4+/CD8+T细胞比例倒置及Treg细胞比例下降。经达那唑或司坦唑醇联合CsA治疗后小鼠Treg细胞比例上升，显著高于单药CsA治疗组(P＜0.05)。进一步检测AA小鼠外周血炎症相关因子，结果显示，达那唑能显著抑制AA小鼠血清中INFγ、TNFα、IL2水平，而司坦唑醇抑制TNFα的作用与达那唑相当，但无明显抑制INFγ、IL2的作用，二者均促进抗炎因子IL10的表达。联合司坦唑醇治疗组小鼠EPO水平高于HGB校正的预期EPO水平，而CsA单药或联合达那唑治疗组小鼠实际与预期EPO水平无明显差异，组间比较△EPO有显著统计学差异(P＜0.05)。各治疗组小鼠实际TPO水平与PLT校正后预期TPO水平无差异。同时，联合司坦唑醇治疗组小鼠骨髓前体细胞EPO受体(EPOR)表达较CsA单药或联合达那唑治疗组小鼠明显增加。 研究结论:司坦唑醇和达那唑均有促造血作用及免疫调节作用。相较于达那唑，司坦唑醇能通过促进EPO分泌并增加骨髓前体细胞EPOR表达而发挥促红系造血优势，而达那唑能较快恢复AA小鼠血小板水平，可能与其较强的免疫抑制作用相关。二者均无体外直接促造血作用。
再生障碍性贫血;司坦唑醇;达那唑;促造血作用;免疫调节
中国医学科学院北京协和医学院
博士
内科学（血液病学）
韩冰
2019
中文
R556.5
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）