维生素A缺乏介导ceRNA失调在先天性脊柱侧凸体节发育中的机制研究
第一部全转录组测序分析鉴定维生素A缺乏诱导先天性脊柱侧凸相关的ceRNA调控网络 研究背景:先天性脊柱侧弯(CS)指胚胎期椎体形成障碍或分节不良导致的一个或多个节段的脊柱三维畸形。CS病因机制尚未完全阐明，而孕早期维生素A缺乏(VAD)可影响胚胎体节形成，导致椎体发育异常。 研究目的:本部分研究基于孕早期维生素A缺乏诱导的先天性脊柱侧凸大鼠模型(VAD-CS)，以体节发育期大鼠胚胎为主要研究对象，通过全转录组高通量测序发现疾病相关的ncRNAs与mRNAs。经多层次的生物信息学分析构建ceRNA调控网络，对具体的ceRNA网络涉及的具体分子功能与机制展开研究，以期揭示VAD-CS相关的发病机制。 研究方法:取妊娠(GD)第9天的大鼠胚胎组织，包含维生素A缺乏组(VAD)9例，对照组(CON)4例，提取总RNA后经实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR)鉴定维生素A体内代谢关键酶及核受体表达情况，并进行全转录组高通量测序。测序数据进行质量控制和初步筛选后，对mRNA(messenger RNA)、longnoncodingRNA(lncRNA)、circularRNA(circRNA)、microRNA(miRNA)的测序结果进行数据比对、验证。通过GO及KEGG分析注释分子功能，并验证差异表达mRNA和ncRNA间的相互作用关系，构建ceRNA调控网络。 研究结果:qRT-PCR结果显示VAD组视黄醛脱氢酶(RALDH)和视黄酸受体(RAR)的表达水平显着低于CON组。初步生物信息学分析共鉴定出两组差异表达的mRNA749个、56个miRNA、685个lncRNA和70个circRNA。分别挑选测序结果中表达上调和下调的mRNA(Cyp4f18，Foxo4)、miRNA(rno-miR-466c-3p, rno-miR-187-5p)、lncRNA(NONRATG024332.1, NONRATG027649.1)和circRNA(chr15_23792823_23793342_+,chr5_50556456_51183813_-)各一个，利用qRT-PCR实验发现8个基因的测序表达趋势与qRT-PCR结果的一致，测序数据质量良好，结果可信度高。GO及KEGG分析认为Wnt、PI3K-ATK、FoxO、EGFR和mTOR信号通路与疾病的发生发展密切相关。构建VAD-CS相关的ceRNA调控网络circRNA-miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA-mRNA网络，并进行可视化展示。 研究结论:全面鉴定了VAD-CS中大鼠胚胎体节发育相关的ceRNA调控网络，揭示了mRNA和ncRNA表达谱，证明了mRNA和ncRNA在CS发病机制中的相关性。 第二部分lncRNASULT1C2A-miR-466c-5p-Foxo4轴在大鼠胚胎体节发育中的分子机制研究 研究背景:近期研究表明非编码RNA(ncRNA)参与CS的发生、发展，但其中特定的竞争性内源RNA(ceRNA)调节网络涉及的分子机制很大程度上仍不确切。 研究目的:本部分旨在通过研究lncRNASULT1C2A，miR-466c-5p和Foxo4在维生素A缺乏(VAD)诱导的CS大鼠模型中的差异性表达，从而确定体节异常发育潜在的分子机制及涉及的信号通路。 研究方法:通过生物信息学分析、siRNA干扰实验和双荧光素酶报告基因检测实验测定验证竞争性内源RNA(ceRNA)lncRNASULT1C2A的分子机制。通过定量RT-PCR(qRT-PCR)和Northernblot检测大鼠胚胎在妊娠(GD)第3，8，11，15和21天其SULT1C2A，rno-miR-466c-5p和Foxo4的表达情况，Westernblot以检查PI3K-AKT信号通路表达情况。 研究结果:生物信息学分析和实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR)表明，在GD9，VAD-CS大鼠胚胎中lncRNASULT1C2A、Foxo4和体节发育相关基因Pax1，Nkx3-2和Sox9表达下调，而rno-miR-466c-5p表达增加。双荧光素酶报告基因实验和siRNA干扰实验显示SULT1C2A作为ceRNA通过直接结合mo-miR-466c-5p抑制其表达，间接上调Foxo4。qRT-PCR和Northernblot发现SULT1C2A-rno-miR-466c-5p-Foxo4轴在GD3，8，11，15和21呈动态改变，尤其在GD11与PI3K和磷酸化AKT(p-AKT)表达趋势一致。 研究结论:lncRNASULT1C2A-miR-466c-5p-Foxo4轴在体节发育早中期参与调控体节发育，lncRNASULT1C2A通过负调节rno-miR-466c-5p表达，间接增强Foxo4的表达，而PI3K-ATK信号通路可能参与其中。
先天性脊柱侧凸;维生素A;体节发育;ceRNA网络;PI3K-AKT信号通路
中国医学科学院北京协和医学院
博士
外科学（骨科学）
沈建雄
2019
中文
R682.3
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）