地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理
皮肌炎(dermatomyositis，DM)是一种主要累及皮肤和骨骼肌的自身免疫性结缔组织病，死亡率高，并发症多，危害大。DM的临床西医治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，疗效有限，毒副作用大，依赖性强;中医辨证施治有优势;皮肌炎常见症候有肝郁，脾虚，血热，根据疏肝，健脾，凉血治则，选用出自明代薛己《内科摘要》的加味逍遥丸经方，其中含有的柴胡皂苷a，阿魏酸，芍药苷，苍术酮，丹皮酚等单体具有抗炎抗过敏和免疫调节作用。地乌为毛茛科银莲花属植物林荫银莲花的根茎，临床治疗自身免疫病效果满意;本课题在前期工作基础上，从抑制巨噬细胞JAK2-STAT3通路，探讨地乌增强加味逍遥丸抑制皮肌炎免疫亢进的免疫药效及药理。 1.皮肌炎大鼠模型建立 [目的]：建立皮肌炎大鼠药效学模型。 [方法]：SD大鼠48只随机分为对照组和不同条件造模组共6组，除对照组外，其它造模大鼠于d0，d7,d14，d28膜抗原致敏，d42，d49，d56，d63膜抗原发敏，d77各组分别给予二氢睾酮，右旋糖酐铁，多粘菌素或三药联合，对照组同步给予生理盐水，建立皮肌炎大鼠模型。d91处死动物，以症状评分观察机能变化，HE及vonkossa染色观察肌肉，皮肤病理改变;ELISA检测血清抗体(Jo-1/MDA5)与细胞因子(TNF-α/IFN-γ)。 [结果]：各造模组出现明显肌无力症状，血清中抗Jo-1抗体，抗MDA5抗体，TNF-α，IFN-γ均有不同程度升高;肌肉组织有不同程度的淋巴细胞浸润，多粘菌素组和三药联用组可见显著血管钙化，其中三药联用组病变最为明显。 [结论]：以膜蛋白诱导自身免疫损伤，环境毒物诱导钙化防御，优化了大鼠皮肌炎的造模条件;该模型符合临床发病，可用于药效评价。 2.地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效 [目的]：探讨地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效。 [方法]：108只SD大鼠雌雄各半，分为对照组，模型组，他克莫司组，地乌组，加味逍遥丸组，加味逍遥丸含地乌组，每组18只;除对照组外，其余造模动物d0，d7膜蛋白致敏，d28，d32，d35，d38，d42发敏，d63给药二氢睾酮，右旋糖酐铁，多粘菌素，建立皮肌炎模型，d28开始每日灌胃给药，他克莫司(0.0056～176.71mg·kg-1·d-1，k=3.16)，地乌(1.06～1060.23mg·kg-1·d-1，k=3.16)，加味逍遥丸(1.83～18173.79mg·kg-1·d-1，k=3.16)，加味逍遥丸含地乌(2.81～27919.42mg·kg-1·d-1，k=3.16)，d70处死动物，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察肌肉病理变化，形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化防御，形态计量钙化结节体积比;免疫组化法检测肌肉切片foxp3，IL-17RA，JAK2，STAT3表达量;各指标用GraphpadPrism5软件非线型可变斜率回归不同药物的半数有效剂量(median effective dose，ED50)，确定方剂药效。 [结果]：各给药组防治皮肌炎呈剂量依赖趋势，量效曲线呈“S”型。复方及其单体组显著缓解肌肉T淋巴细胞浸润比，钙化结节体积比，增高肌肉中foxp3表达量，降低IL-17RA，JAK2，STAT3表达量。以地乌剂量为标识，与地乌组相比，加味逍遥丸加地乌组曲线左移，T淋巴细胞浸润体积比，钙化结节体积比，IL-17RA表达量，Foxp3表达量JAK2表达量，STAT3表达量ED50是地乌组的0.70倍，0.44倍，0.74倍，0.81倍，0.35倍，0.60倍;以加味逍遥丸剂量为标识，与加味逍遥丸组比，同等剂量下加味逍遥丸加地乌组曲线左移，T淋巴细胞浸润体积比，钙化结节体积比，IL-17RA表达量，Foxp3表达量，JAK2表达量，STAT3表达量ED50是加味逍遥丸复方组的0.63倍，0.72倍，0.71倍，0.68倍，0.48倍，0.71倍;以上结果提示配伍地乌对方剂有增效作用。 [结论]：地乌能增强加味逍遥丸复方治疗皮肌炎，且具有剂量依赖性，可能通过调节免疫防治皮肌炎。 3.地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理 [目的]：探讨地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理。 [方法]：60只SD大鼠分为对照组，模型组，他克莫司组，加味逍遥丸加地乌复方低中高剂量组;除对照组外，其余动物d0，d7膜蛋白致敏，d28，d32，d35，d38，d42发敏，d63给药二氢睾酮，右旋糖酐铁，多粘菌素，建立皮肌炎模型，d28开始每日灌胃给药他克莫司(3.12mg·kg-1·d-1)复方低(664.56mg·kg-1d-1)，复方中(2100.00mg·kg-1 ·d-1)，复方高(6636.00mg·kg-1 ·d-1)，d70处死动物，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE staining)染色观察肌肉病理变化，形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化，形态计量钙化结节体积比;ELISA法检测血清中促炎因子TNF-α，IL-1β的含量;采用免疫组化法测定脾脏CCR2，肌肉和脾脏foxp3表达量，实时定量RT-PCR和Westemblot法检测肌肉和脾脏JAK2，STAT3表达水平;免疫组化和Westemblot法检测肌肉和脾脏pSTAT3表达水平及其入核比。 [结果]：(1)药效观察:①大体观察:与模型组比，各给药组均不同程度上改善大鼠四肢红肿，肌无力等DM临床表现②病理观察:与模型组比，各给药组明显改善大鼠肌肉组织束周萎缩，肌细胞变性坏死情况，各给药组均能显著抑制T淋巴细胞浸润;③钙化结节体积比:与模型组比，各给药组不同程度地抑制皮下组织钙化结节生成;与FK506比，复方低中高剂量组无差异;④TNF-α:与模型组比，各给药组不同程度减少血清TNF-α水平;⑤IL-1β:与模型组比，各给药组不同程度减少血清IL-1β的释放;与FK506组比，复方中高剂量组无差异。(2)机制初探:①CCR2:脾脏IHC显示，与模型组比，各给药组不同程度降低CCR2原位蛋白表达，其中复方低中高剂量组CCR2原位蛋白表达显著降低，与FK506组比无差异;②JAK2:在肌肉和脾脏组织中，IHC，RT-PCR，Westemblot显示，与模型组比，各给药组不同程度下调巨噬细胞JAK2基因和蛋白水平③STAT3:在肌肉和脾脏组织中，IHC，RT-PCR，Westernblot显示与模型组比，各给药组不同程度下调巨噬细胞STAT3基因和蛋白表达④pSTAT3入核比:肌肉IHC显示与模型组比，各给药组不同程度降低pSTAT3入核比，复方中剂量显著降低pSTAT3入核，与FK506比无差异。 [结论]：加味逍遥丸含地乌复方通过下调巨噬细胞JAK2-STAT3通路抑制T细胞增殖活化，恢复免疫平衡防治皮肌炎。
地乌增效加味逍遥丸;免疫药理;皮肌炎
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
生药学（药学）
蔡大勇
2019
中文
R285.5
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）