胱硫醚β合酶在维持肠干细胞稳态中的作用研究
研究目的： CBS的发现和相关功能研究尽管已开展多年，但CBS/H2S通过调节相关信号和代谢通路来影响干细胞功能的研究最近才逐渐增多。我们的假说是CBS/H2S可能调控了肠干细胞的增殖分化相关通路和肠干细胞微环境细胞的应激反应，CBS/H2S相关的调节剂可以用来调控肠黏膜的损伤和修复。因此，本研究首先明确了CBS在肠道细胞的表达模式，建立了肠干细胞离体3D培养模型，利用CBS的药理性抑制剂和CBS肠上皮条件基因敲除小鼠，初步探讨了CBS在肠干细胞稳态中的作用;进而利用抑制剂和条件基因敲除小鼠，在DSS诱导的结肠上皮损伤模型、电离辐射诱导的肠干细胞离体3D培养模型和小肠/结肠上皮损伤动物模型上对CBS的功能和CBS/H2S通路调节剂的作用进行了初步观察。这些研究从气体分子信号角度对肠干细胞稳态维持产生了新的认识，为通过调节CBS/H2S通路干预肠道屏障维持和组织再生提供了新的理论基础。 研究方法： 1.CBS在小鼠体内肠组织和肠干细胞离体3D培养模型中的表达特点 1.1 CBS在小鼠体内肠组织的表达特点 通过免疫组化（immunohistochemisty，IHC）和免疫荧光(immunofluorescence，IF)染色的方法，观察CBS在小肠和结肠中的定位分布;通过Western blot(WB)的方法，检测不同节段肠组织上皮细胞中CBS和CSE的定量表达; 1.2建立小肠隐窝离体3D培养模型 参考文献方法，建立小肠隐窝离体3D培养模型，观察该体系中的克隆正常生长形态，并对CBS、Ki67等分子进行染色观察; 1.3 CBS在小鼠肠干细胞离体3D培养模型中的表达特点 通过适时收集离体培养的隐窝克隆，通过WB、real-time PCR和IHC的方法，观察CBS在离件模型中的表达特点。 2.CBS在小鼠肠干细胞稳态中的作用研究 2.1药理性抑制剂对离体培养的肠干细胞稳态的影响 通过在离体培养体系中添加CBS抑制剂氨基氧醋酸(aminooxyacetic acid，AOAA)、CSE抑制剂炔丙基甘氨酸(propargylglycine，PAG)和外源性H2S供体GYY4137，观察其对肠干细胞增殖的影响，通过比较干性基因Lgr5、Olmf4、Ascl2和分化后基因Krt20的变化，反映相关分子在维持小肠干细胞稳态中的作用; 2.2敲除肠上皮细胞的CBS对肠干细胞稳态的影响 利用两种不同品系的CBS条件敲除小鼠，比较敲除鼠和对照鼠的离体肠干细胞克隆生长差异，结合CBS在离体模型中的表达特点，反映CBS在离体模型中对维持小肠干细胞稳态的作用: 3.在体内DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中观察CBS缺失对上皮损伤的影响 3.1观察野生型小鼠在DSS诱导后的结肠病理变化和CBS表达情况，建立小鼠溃疡性结肠炎模型 3.2比较CBS基因条件敲除条件后DSS诱导的结肠上皮损伤程度，初步观察CBS在该病理模型中可能作用 4.CBS在电离辐射致肠损伤中的作用观察 4.1离体隐窝3D培养辐射模型的建立，确立恰当的照射剂量和时间， 4.2初步检测CBS抑制剂氨基氧醋酸(aminooxyacetic acid，AOAA)和外源性H2S供体GYY4137对电离辐射后的organoid的影响。 4.3 CBS flox/Villin-CreERT2小鼠经诱导敲除肠上皮细胞CBS的表达后，经全身辐照，观察照后小鼠的一般状态和肠组织病理变化，比较不同小鼠的损伤差异 4.4分别给予腹腔注射AOAA和GYY4137后，经全身辐照，观察照后小鼠的一般状态和肠组织病理变化，比较不同干预方式对肠损伤的差异。 研究结果： 1.CBS在小鼠体内肠组织和肠干细胞离体3D培养模型中的表达特点 1.1 CBS在小鼠体内肠组织的表达特点 CBS在小肠各节段的上皮组织（绒毛和隐窝）中均未检测到明显表达，但在小肠间质中有一定的表达;在结肠组织中，CBS在上皮细胞中明显表达，且相对集中定位于结肠隐窝中下部的区域，和Lgr5-GFP标记的干细胞有位置重叠。CSE在各节段肠上皮中广泛表达，相对集中于小肠远端的回肠部位。 1.2建立小肠隐窝离体3D培养模型 成功建立小肠隐窝离体3D培养模型，并观察到其生长形态的典型特征为:Day0保持隐窝分离时的棒状形态;Day1时存活的隐窝克隆呈球形，具有良好的折光性;Day2时部分隐窝克隆可见出芽;Day3时大部分克隆可见出芽，出芽数量开始逐渐增多;Day4时克隆出芽明显且增殖旺盛，克隆体积较接种早期明显增大，部分克隆中央区域的细胞因无法获取足够的营养成分和刺激因子，开始逐渐分化、死亡，克隆中央区域折光性开始变暗;之后克隆开始逐步老化，出芽逐渐不明显，同时中央区域的死亡细胞增多，折光性变差。 1.3 CBS在小鼠肠干细胞离体3D培养模型中的表达特点 在离体培养体系中，随着培养时间的延长，CBS逐渐开始明显表达，其表达量在24h开始增高，至接种后72h-96h达到较高水平。通过激光共聚焦扫描显示:CBS在隐窝微器官克隆中有明显表达，且相对集中于具有较强增殖能力的出芽区域，提示其可能与干细胞的自我更新和增殖相关。 2.CBS在小鼠肠干细胞稳态中的作用研究 2.1药理性抑制剂对离体培养的肠干细胞稳态的影响 CBS抑制剂AOAA在离体培养的肠干细胞中可降低干性基因Lgr5、Olmf4和Ascl2的表达，增加分化后上皮标志Krt20，并伴有细胞存活率的显著降低。提示AOAA可通过降低干细胞干性，促进分化的方式，加速隐窝克隆的分化和死亡，导致细胞存活率下降;CSE的抑制剂PAG则对肠干细胞未见有显著的影响，外源性的H2S供体GYY4137在一定程度上可延缓隐窝克隆的老化和细胞的死亡; 2.2敲除肠上皮细胞的CBS对肠干细胞稳态的影响 通过CBS的条件敲除小鼠，在离体模型中证实了CBS的缺失会导致隐窝克隆的出芽数量减少，且出芽受抑的时间点与离体系统中CBS被诱导成高表达状态的时间点吻合。提示在离体培养条件下，CBS的缺失导致了肠干细胞的自我更新和增殖能力受到影响; 3在体DSS溃疡性结肠炎模型中CBS缺失对上皮损伤修复的影响 3.1通过不同时间点的小鼠一般状态观察和结肠病理观察，成功构建小鼠溃疡性结肠炎模型。并发现间质细胞CBS表达上调，上皮细胞CBS表达下调。 3.2主要发现CBS肠上皮特异敲除小鼠的上皮组织损伤更为严重，肠镜观察显示溃疡灶数量和分布范围增多，粘膜出血更重;肠组织病理观察见受损区域的炎性细胞浸润增多，形成严重溃疡区域的范围显著增加。提示CBS的缺失可能抑制了结肠上皮在炎性溃疡形成后修复。 4.CBS在电离辐射致肠损伤中的作用观察 4.1对接种不同时间的小鼠小肠隐窝进行不同剂量的辐射实验，找到了模拟在体急性放射病的相关剂量6Gy，在此照射剂量下应用CBS抑制剂AOAA或H2S供体GYY4137，未见到对隐窝类器官辐射后再生有明显影响。 4.2通过比较10Gy（0.77Gy/min，X线）照后的CBS肠上皮细胞敲除小鼠和对照小鼠在照后3.5天肠道病理切片，未发现肠组织受损程度存在显著性差异。 4.3对10Gy全身辐照小鼠在辐照前给予CBS抑制剂AOAA或H2S供体GYY4137，照后3.5天肠道病理取材显示，GYY组小鼠精神极度萎靡，活动度极差，小肠肿胀明显，长度缩短，病理显示绒毛结构缺失，隐窝再生障碍，提示GYY4137加重了辐射后肠道炎症反应，导致黏膜屏障严重受损。而AOAA组较溶剂对照组活动度相似，未见小肠长度缩短，HE染色显示绒毛较完整，隐窝克隆新生数目略高于溶剂对照组。 研究结论： 本课题利用肠干细胞的离体3D培养模型和条件性基因修饰小鼠，系统研究了CBS/H2S在肠干细胞稳态维持中的作用。并对CBS抑制剂AOAA或H2S供体GYY4137在干预辐射后的肠道损伤修复做了初步观察。本课题的主要结论有: 1.离体培养干细胞需要CBS/H2S通路维持细胞干性，正常情况下在体肠上皮更新不需要CBS。 2.溃疡性结肠炎造成的肠上皮黏膜缺损后的有效修复需要上皮激活CBS/H2S通路。 3.电离辐射后小肠上皮修复不需要CBS/H2S激活，CBS抑制剂AOAA或H2S供体GYY4137可能主要通过调节间质的免疫细胞而不是上皮细胞来调控肠道损伤修复。
肠干细胞;细胞增值;胱硫醚β合酶;调控机制
陆军军医大学
博士
军事预防医学
粟永萍
2016
中文
R329.28
2020-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）