经典Wnt和Notch信号在干细胞介导肝再生与恶性转化中作用及机制研究
目的： 肝脏疾病是严重危害着我国人民健康的常见病、多发病，涉及炎症、肿瘤等领域，例如各种类型的病毒型肝炎、免疫性肝炎、胆汁淤积肝病、肝硬化、肝脏良恶性肿瘤等。长期以来，内科药物、微创介入、外科手术是治疗肝脏疾病的主要手段;近年来，随着医学的进步，肝脏疾病的诊疗模式上越来越倾向于“多学科合作模式”，治疗手段也日渐丰富，因此，部分肝脏疾病的治疗取得巨大进步。然而，终末期肝病、肝恶性肿瘤这部分肝病的预后仍然较差，究其原因是多方面的:如对疾病的发生、发展尚完全明确，即基础研究尚需进一步深入;其次，对基础研究的结果有待进一步转化。近年来，干细胞在肝脏的生理和病理生理中发挥的作用得到越来越多的证实与发现:参与肝脏的胚胎发育、参与肝损伤的修复、参与肝肿瘤的发生等。毫无疑问，从干细胞的角度审视肝脏疾病的发生发展，将对人类认知肝脏疾病，寻找新的治疗手段提供思路。 外科手术是治疗肝脏疾病的重要手段。近20年来，随着科学的发展、技术的革新，临床肝脏手术取得了巨大进步。以肝切除术为例而言，其术式已从单纯的肝叶切除发展到扩大的肝叶、肝段切除;操作方法从传统的开腹手术发展为全腔镜下肝切除或达芬奇机械人肝切除术;操作时期从一期手术发展为二期手术，例如，近年来兴起的联合肝脏分隔和门静脉结扎的分期肝切除术(associating liver partition with portal vein ligation forstaged hepatectomy，ALPPS)，简称为ALPPS术。临床研究发现，ALPPS术第一阶段的手术是目前已知术式中的肝再生效果最理想的一种，但其肝脏迅速再生的机制尚不明确。因此，无论肝脏外科如何进步，都离不开肝再生这个永恒的话题。研究证实:在肝脏严重受损时，肝干细胞、肝卵圆细胞可以被大量动员、激活，并迅速分化为肝细胞和/或肝胆管上皮细胞，从而补充肝脏受损的实质细胞。肝干细胞是肝脏生理和病理生理过程的重要连接点，具有多方向分化的特点，在肝脏遭遇严重创伤时，其能成肝分化，参与肝再生过程进行损伤修复。那么，在肝恶性肿瘤的发生、发展中，它又扮演什么角色呢？是积极的抗肿瘤作用，或是消极的成为肿瘤的帮凶呢？肝癌干细胞(liver cancerstem cell，LCSC)理论的提出揭示了肝干细胞在肝恶性转化中发挥了积极作用。干细胞究竟如何参与肝再生或恶性转化，以及参与这些事件的调控机制尚不明确。 众所周知，细胞信号传导通路是调控细胞命运的重要因素。业已证实:Wnt、Notch、Hedgehog细胞信号通路在干细胞分化、恶性转化等事件中发挥重要的作用。在我们前期的研究中发现，Notch信号通路能促进肝干细胞向胆管细胞分化，同时与Hippo信号通路形成正反馈调节对于正常肝干细胞(liver nomal stem cell，LNSC)和LCSC功能维持起到重要作用。Wnt信号通路是生物体进化高度保守的通路，在效应器官肝脏内参与诸多分子事件，并与Notch、Hedgehog等信号通路形成交叉和网络，相互调控并制约。但针对Wnt信号通路能否调控干细胞成肝分化并在肝再生中发挥重要的作用，相关研究尚未见报道。此外，由于在我们前期证实Notch抑制剂能促进肝干细胞的成肝分化，因此我们推测Notch抑制剂可能适用于针对LCSCs的诱导分化治疗，可能为肝癌治疗提供新的治疗策略。 基于以上分析，本研究首先从SD大鼠中分离、纯化、培养胎肝干细胞(fetal liver stemcells，FLSCs)和成熟肝细胞(Mature Hepatocytes，MHs)，以经典Wnt和Notch信号为干预措施，从细胞和动物两个水平，观察这两条信号通路在肝再生和恶性转化中的作用和可能机制，实验设计分为三部分。 第一部分:经典Wnt信号对大鼠FLSC成肝分化的作用及机制研究 实验一大鼠FLSC经典Wnt信号表达的初步探讨 目的:检测并筛选出Wnt/β-catenin信号通路中与干细胞分化、肝脏再生密切相关的受体、配体及下游靶基因。方法:参照本实验室前期建立“三步法”分离SD大鼠的胎肝干细胞FLSCs和MHs，然后利用Realtime PCR检测Wnt受体(DVL-1、DVL-2、LRP-5、LRP-6)、配体(Wnt3a、Wnt2、Wnt8、Wnt5a、Wnt10h、Wnt11)及下游基因(C-Myc、Cyclin-D1、HNF-4α)，用免疫荧光检测Wnt受体在大鼠FLSC中的表达。结果:成功分离、提纯了大鼠FLSCs和MHs，发现受体LRP-6、下游基因HNF-4α在mRNA转录水平上有显著升高，而且LRP-6蛋白的表达与经典干细胞标志EpCAM在FLSC中共表达。结论:Wnt/β-catenin信号可能参与FLSC向MH的分化，并筛选出关键分子与干细胞分化及肝脏再生相关受体LRP-6和下游基因HNF-4α分子可能参与。 实验二经典Wnt信号对FLSC成肝分化的作用及其机制研究 目的:验证Wnt/β-catenin信号通路在FLSC成肝分化中的作用及其机制。方法:构建大鼠基因β-catenin的慢病毒干扰载体，并将FLSC分四组进行诱导，分别为:A组（Wnt/β-catenin激动组）、B组（Wnt/β-catenin抑制组）、C组（正常组）、D组（阴性对照组），并设立MH作为阳性对照组为E组，运用透射电镜、免疫荧光染色和分子生物学等检测在形态学、表面标记物、代谢功能、合成功能进行检测。结果:慢病毒载体能有效抑制FLSC的β-catenin信号，实验方法可靠;激活Wnt/β-catenin信号，显著促进了FLSC向成熟肝细胞的分化，而且在分化过程中LRP-6和经典干细胞标志EpCAM在mRNA转录上水平存在一致性。结论:Wnt/β-catenin信号能正向调控FLSC成肝分化，其可能的机制与激活下游信号HNF-4α有关;此外LRP-6可能是肝干细胞潜在的标记物。 第二部分:经典Wnt信号调控FLSC参与肝再生的作用及机制研究 实验一 Wnt/β-catenin信号激动剂对大鼠PH后肝再生的作用及机制 目的:通过阻断肝细胞的增殖，利用经典肝切除大鼠模型验证Wnt/β-catenin信号介导的干细胞在肝再生的作用。方法:SD大鼠45只，随机分为三组:A组为单纯PH组;B组为“PH+倒千里光碱(TWS119)注射组”;C组为“PH+倒千里光碱注射组+Wnt激动剂”，然后从肝功、形态学、肝增殖情况、免疫荧光双标染色以及相关基因mRNA表达及蛋白定量进行观察Wnt/β-catenin激动剂对肝切除大鼠模型的干预效应。结果:TSW199处理的大鼠70％ PH模型术后7天的肝功显著改善，ALT分别为C组:151.3±34.9，B组:251.3±34.9，差异有显著性;术后7天的肝增殖情况改善，Ki67阳性细胞指数分别40.6±5.37和15.5±2.18，差异有显著性，Ki67/EPCAM免疫双染的阳性细胞。结论:Wnt/β-catenin信号能促进肝干细胞的动员从而改善肝损伤的修复。 实验二 Wnt/β-catenin信号在大鼠ALPPS术后肝再生的作用及机制研究 目的:利用大鼠ALPPS模型，验证Wnt/β-catenin通路激动剂在严重肝损伤后肝再生的作用及其机制。方法:SD大鼠45只，随机分为三组:A组:为门静脉结扎组，拟用为传统方式刺激肝脏再生。B组:为ALPPS组，即实验组。C组:为门静脉结扎组+Wnt激动剂组。然后通过形态学、肝功、肝增殖情况、Wnt/βcatenin信号组化及mRNA表达、蛋白定量的检测，观察Wnt/β-catenin信号通路是否介导干细胞参与其再生。结果:ALLPS术后肝增殖及β-catenin含量均高于其余两组，CK19阳性细胞计数高于其余两组。结论:ALLPS术后肝再生可能与激活经典Wnt信号动员肝干细胞参与肝再生有关。 第三部分: Notch信号在肝干细胞恶性转化中的作用及机制研究 目的:通过慢病毒将HOTAIR转入LNSCs，制备恶性转化的细胞模型，观察Notch信号在肝干细胞恶性转化中的作用及机制。方法:应用Notch抑制剂诱导恶性转化细胞分化为成熟肝细胞，观察其增殖力、侵袭力，进行裸鼠成瘤实验，进行肝细胞功能实验。结果:抑制Notch信号通路可以下调肿瘤相关的干性标记物，降低增殖状态、减轻侵袭性、减弱转移倾向;能促进已恶性转化的细胞成肝分化，重新获得合成糖原和白蛋白、清除吲哚菁绿等成熟干细胞功能。结论:Notch抑制剂的抗肿瘤作用不仅可以直接杀死肿瘤细胞或LCSCs，还可以诱导LCSCs通过间质上皮细胞转化(MET)分化为成熟肝细胞，降低恶性程度。 结论： 1.Wnt/β-catenin信号能正向调控FLSC向MH分化，其可能的机制与激活下游信号HNF-4α有关;LRP-6可能是肝干细胞潜在的标记物;Wnt/β-catenin信号能促进肝干细胞参与肝再生修复肝损伤，ALLPS术后肝再生可能与激活经典Wnt信号动员肝干细胞参与肝再生有关。 2.Notch抑制剂的抗肿瘤作用不仅可以直接杀死肿瘤细胞或LCSCs，还可以诱导LCSCs通过间质上皮细胞转化(MET)分化为成熟肝细胞，降低恶性程度。
肝癌;干细胞;肝再生;恶性转化;细胞信号通路;免疫机制
陆军军医大学
博士
外科学（普外）
汤礼军
2018
中文
R735.7;R730.3
2020-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）