miR--146a在B细胞IgE类别转换及免疫反应中的作用研究
B细胞是免疫系统的重要组成，主要通过产生大量抗体参与机体体液免疫过程。在免疫反应过程中B细胞还可以为T细胞提呈抗原及分泌相关细胞因子。B细胞抗体分泌异常会诱发多种自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE))发生。B细胞还在多种过敏性疾病（哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等）发病过程中发挥重要作用。在哮喘发病过程中B细胞主要表现为产生大量IgE抗体。 在B细胞的发育分化过程中涉及多种分子信号的调节，miRNAs便是其中一种主要调节因素。Dicer敲除实验证实miRNA在B细胞早期与晚期发育中均发挥关键调节作用。miRNAs调控异常会引起B细胞相关疾病（如B细胞恶性肿瘤）发生。 miR-146a是miR-146miRNAs家族中的重要一员，miR-146a可以调节免疫细胞的增殖与分化，进而在天然免疫与获得性免疫过程中发挥调节作用。研究表明miR-146a靶向作用于TRAF6与IRAK1两个NF-κB信号通路中的重要分子进而调节天然免疫反应。miR-146a缺陷会导致B细胞骨髓外增殖减少从而引起外周B细胞数量全面降低。 课题组前期在对miR-146a转基因鼠的研究中发现miR-146a过表达会引起小鼠淋巴结肿大，淋巴结生发中心B细胞增多。生发中心是B细胞发生类别转换的关键部位，推测淋巴结生发中心B细胞增多有可能会引起B细胞类别转换异常。ELISA检测miR-146a转基因鼠与野生对照鼠血清抗体水平结果显示在Balb/C品系小鼠中miR-146a转基因鼠血清中IgE水平明显高于野生对照鼠，流式细胞分析结果也证实miR-146a转基因鼠骨髓中IgE阳性细胞明显高于野生对照鼠。在以往的研究中Balb/C品系小鼠常被用作诱导IgE表达，因此为进一步确认IgE表达增加是因miR-146a引起而非小鼠品系的影响又构建了另外一种品系(C57BL/6)的miR-146a转基因鼠。该品系小鼠血清中IgE抗体检测结果与前一品系一致，miR-146a转基因鼠血清中IgE抗体水平明显高于野生对照鼠。推测miR-146a表达引起不同品系转基因鼠IgE类别转换增加进而导致IgE抗体分泌增多及IgE阳性细胞比例升高。 在正常生理状态下，机体IgE抗体维持较低水平且IgE的产生受到机体严格调控。IgE抗体被证明在多种过敏性疾病（哮喘、过敏性休克等）中发挥重要作用。为研究病理条件下miR-146a对B细胞IgE类别转换的影响，利用OVA抗原致敏小鼠构建小鼠哮喘模型。结果显示OVA致敏后引起小鼠肺部大量炎性细胞浸润伴随气道粘膜增生及管腔狭窄，miR-146a转基因鼠血清中OVA抗原特异性的IgE抗体水平明显高于野生对照鼠，两组小鼠肺泡灌洗液中细胞因子水平(IL-4，IL-5，IL-13)均比致敏前明显升高。结果表明OVA抗原刺激引起miR-146a转基因小鼠B细胞IgE类别转换增多。结果还显示miR-146a转基因小鼠BALF中炎性细胞数量要低于野生对照鼠，并且转基因鼠BALF中嗜酸性粒细胞的比例要低于野生对照鼠，这与Kips及Kang等的研究一致，IgE的大量产生会减轻肺部炎性浸润并且与嗜酸性粒细胞的分泌不一定成正相关。高浓度OVA刺激会引起小鼠大量死亡，miR-146a转基因鼠的死亡率要明显低于野生对照鼠，推测在哮喘疾病发病中miR-146a促进IgE分泌增多可能发挥负向调节作用。 生发中心既是B细胞发生类别转换的部位还是B细胞抗体亲和力成熟的部位。为进一步研究miR-146a引起的生发中心B细胞增多对抗体亲和力成熟的影响，利用NP-KLH抗原刺激小鼠，检测小鼠抗原特异性抗体的分泌，探讨miR-146a过表达对小鼠B细胞抗体亲和力成熟的影响。结果显示在抗原刺激条件下，抗原特异性抗体差异主要体现在第二次免疫后，即记忆性免疫反应阶段。在接触抗原第二次刺激后，miR-146a转基因小鼠抗原特异性IgM与IgG抗体水平迅速升高。随着抗原反应进程增加，两实验组之间抗原特异性抗体水平均有所回落并趋于一致。计算两次免疫过程不同时间点抗体亲和力成熟结果显示在两次免疫过程中，虽然不同时间点不同亲和力抗原特异性抗体水平存在差异，但在整个实验过程中两组之间抗原特异性抗体亲和力成熟并没有统计学差异。利用流式细胞分析第二次免疫反应后不同时间点抗原特异性B细胞的活化情况，结果显示在第二次抗原免疫过程中miR-146a转基因鼠B细胞比野生B细胞活化增强，B细胞活化后会分化为抗体分泌细胞从而产生大量抗原特异性抗体，细胞活化分析结果也证实了抗原特异性抗体检测结果。 为进一步研究miR-146a对B细胞IgE类别转换的作用机制，首先进行了B细胞体外培养实验。在体外分选脾脏na(i)ve B细胞，在培养体系中添加LPS与IL-4进行培养，培养3天后检测到miR-146a转基因鼠B细胞中IgE阳性细胞的比例明显增加且细胞培养上清中IgE抗体水平明显高于野生对照鼠B细胞培养上清。结果证实miR-146a过表达引起IgE细胞增多及抗体分泌增多是B细胞的内在机制在发挥作用。随后对这一影响的分子机制展开研究，利用同位素标记的TMT技术进行B细胞蛋白定量分析，比较差异蛋白发现miR-146a转基因鼠B细胞14-3-3sigma蛋白表达较野生鼠B细胞明显上调，有研究指出14-3-3sigma可以通过招募AID结合S区进而促进B细胞类别转换。在miR-146a转基因鼠B细胞上调蛋白中还发现类别转换与免疫反应的重要调控蛋白APOBEC3，研究指出感染条件下APOBEC3蛋白会明显增强机体的天然免疫反应，且APOBEC3是类别转换相关复合体AID/APOBEC3的重要组成部分。在下调蛋白中发现已被研究者证实的miR-146a的靶基因smad4，有研究证实smad4下调会引起14-3-3sigma的明显上升。mRNA qPCR检测结果与蛋白定量分析结果一致。 全文总结: (1)miR-146a增强B细胞IgE类别转换，引起IgE阳性细胞比例上升及血清IgE抗体水平升高。 (2)OVA刺激病理条件下，miR-146a转基因鼠OVA特异性IgE抗体分泌明显增加。 (3)miR-146a增强B细胞记忆性免疫反应，促进第二次抗原刺激条件下B细胞抗体分泌，对B细胞免疫过程中抗体亲和力水平并无影响。 (4)B细胞体外培养实验证实miR-146a对B细胞IgE类别转换的影响是B细胞内在机制在发挥作用。蛋白差异分析及mRNA检测结果显示14-3-3sigma与APOBEC3蛋白上调，smad4蛋白表达下调。据此推测miR-146a可通过直接结合于3'-UTR区下调smad4表达，进而引起了14-3-3sigma表达上调，14-3-3sigma的上调引起B细胞类别转换增加及免疫反应增强。另外miR-146a上调APOBEC3表达的分子机制还需进一步功能学实验验证。
B细胞;IgE抗体;免疫反应;非编码RNA-146a
陆军军医大学
博士
免疫学
万瑛
2016
中文
R392.12
2020-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）