阿片受体及信号传导蛋白在慢传输型便秘结肠表达变化及作用的研究
目的： 慢传输型便秘(Slow Transit Constipation，STC)是一种由于涉及全胃肠道动力紊乱、尤其是结肠传输减慢导致的便秘，多见于育龄期妇女。其主要特征是无便意、大便次数减少，多伴有长期服用刺激性泻剂病史。其症状顽固、治疗棘手，有的患者最终需行结肠次全切或全切除术。刘宝华总结了慢传输便秘各术式治疗效果，认为全结肠切除及次全切除术均能明显改善慢传输型便秘症状，半年后患者对手术满意度在90％以上。结肠运动功能失调是慢传输型便秘的原因，但导致其运动功能失调的病因却仍不明。目前一些理论尝试通过神经纤维缺失、自主神经疾病、肠道神经系统与肠道内分泌系统功能失调等方面解释慢传输型便秘的病因。另外，一些学者认为慢传输型便秘患者结肠神经系统也存在病变。有研究发现，泻剂和一些神经递质能抑制结肠收缩反应。表现为结肠推进性蠕动的高振幅电信号数量明显减少，持续时间亦明显缩短。泻剂结肠是慢传输型便秘的一种常见临床类型，张连阳等针对便秘发生过程，模拟便秘患者有长期服用接触性泻剂的病史，使用大黄、酚酞作为接触性泻剂，成功建立了“泻剂结肠”模型。 调控胃肠道功能的肠神经系统（Enteric Nervous System，ENS），是脊柱动物最大、最复杂的外周自主神经系统，包含数量众多的神经细胞，并且拥有与中枢神经系统类似的神经递质和神经调节因子。ENS在肠道形成两个主要的神经丛:粘膜下神经丛(Submucosal Plexus)和肌间神经丛(Myenteric Plexus)，控制肠道的运动、经粘膜的液体交换、血流以及胃肠道激素的分泌。所有这些肠道神经元，根据其功能，可分为初级传入神经元（Primary Afferent Neurons）、中间神经元(Interneurons)、运动神经元(Motor Neurons)等，而运动神经元又分为兴奋性及抑制性两类。肠道抑制性神经元可表达一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthetase，NOS)，同时可表达血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP），而兴奋性神经元可表达乙酰胆碱转移酶（Choline Acetyltransferaea，Chat），部分可同时表达速激肽(Tachykinin，TK)。对便秘结肠标本的研究表明，其肠壁神经元存在数量减少且变性的表现。 阿片受体属于与G蛋白家族偶联的代谢型膜受体，主要在ENS表达，分为μ-（μ-opioid receptor,MOR）、δ-(δ-opioid receptor,DOR)、κ-(κ-opioid receptor,KOR)三种亚型。当阿片受体激活后，随即产生浓度依赖的内吞效应，进入胞内，通过激活K+通道、膜超极化、抑制Ca+通道及环磷酸腺苷的产生发挥其生物学效应。阿片受体激动剂能同时阻断ENS的兴奋性及抑制性神经元;阻断兴奋性通路能抑制兴奋性神经递质（如乙酰胆碱）释放，进而阻断肠道平滑肌张力依赖性蠕动收缩;阻断抑制性通路能减少抑制性神经递质（如一氧化氮）释放，增加平滑肌静息张力和非推进性蠕动。目前认为，μ、δ、κ三种阿片受体亚型在调节胃肠道功能的过程中起着重要的作用。 阿片受体本身是一个具有7个穿膜区域的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCR)，与阿片受体激动剂引起的信号改变相关联，并最终引起各种阿片样反应，包括止痛、欣快感、便秘及呼吸抑制等。G蛋白信号调节蛋白(Regulator Of G-Protein Signaling，RGS)家族有大约30多种。RGS4属于RGS蛋白家族中的R4亚家族，在结构上拥有RH域及一个小的N末端，调节MOR、DOR与G蛋白特异性结合及信号传导方面起着重要的作用，其过表达能明显降低MOR的活性。 β-arrestin2属于arrestin蛋白家族，以脱敏(Desensitization)、隔离（Sequestration）、下调(Downregulation)、复敏(Resensitization)等方式对阿片受体的信号转导进行特异性调节。 本课题希望针对三型阿片受体及其信号调节相关蛋白RGS4、β-arrestin2在“泻剂结肠”动物模型及慢传输型便秘患者结肠的表达情况进行研究，结合各型阿片受体对“泻剂结肠”肌条的电生理作用，初步揭示各型阿片受体及其信号调节相关蛋白RGS4、β-arrestin2在“泻剂结肠”及慢传输型便秘肠道低反应性中所起作用。 方法： 1)按张连阳文献报道，以反复多次饲以含酚酞饲料方法喂养Wistar大鼠，建立泻剂结肠大鼠模型，以正常饲养大鼠作为对照组;随机选取2012年4月至2013年6月在第三军医大学大坪医院胃结直肠肛门外科行手术治疗的慢传输型便秘患者作为实验组，以同期行右半结肠根治性切除术的结肠肿瘤患者作为对照组，均留取右半结肠全层组织用于实验。H&E染色法验证泻剂结肠大鼠模型。 2)RT-qPCR法检测泻剂结肠大鼠及慢传输型便秘患者结肠内阿片受体(MOR、KOR、DOR)及信号调节蛋白RGS4、β-arrestin2mRNA表达的变化，并与对照组相比较。 3)Western-blot法泻剂结肠大鼠及慢传输型便秘患者结肠内阿片受体(MOR、KOR、DOR)及信号调节蛋白RGS4、β-arrestin2蛋白表达的变化，并与对照组相比较。 4)Powerlab多通道电生理仪检查泻剂结肠大鼠肌条对阿片受体(MOR、DOR、KOR)不同浓度(0.05umol/L、0.1umol/L、1.0umol/L)激动剂及拮抗剂张力的变化。 结果： 1)泻剂结肠组完成3个循环试验时间共120天，无死亡，体型稍有消瘦，体重与给药前无明显变化，部分大鼠口鼻处有少量淡红色分泌物。首次腹泻是酚酞剂量为1200mg/Kg，完成3次循环最终药物剂量为3400mg/Kg。H&E染色结果显示，正常对照组结肠组织层次分明，环肌（Circular Muscle，CM）及纵肌（Longitudal Muscle，LM）纤维间连接紧密、染色均匀，位于二者间的神经元(Neurons，NS)形态饱满，胞核与胞浆明显;而泻剂结肠组见肠壁肌纤维间连接松散，着色不均，有较多空泡状变，神经元细胞皱缩明显，胞核与胞浆结构破坏，提示泻剂结肠大鼠模型建立成功。 2)RT-qPCR法对阿片受体(MOR、KOR、DOR)rnRNA表达检测结果显示，与对照组相比，泻剂结肠大鼠和慢传输便秘患者结肠的三种阿片受体mRNA表达均明显增高(P＜0.01)。 3)Western-blot法对阿片受体(MOR、KOR、DOR)蛋白表达检测结果显示，泻剂结肠和慢传输型便秘组与对照组比较，三种阿片受体蛋白表达均明显增高(P＜0.01)。 4)采用Powerlab多通道电生理仪检查泻剂结肠大鼠结肠肌条自发性张力变化的研究结果: a.在肌条达到等长收缩状态的静息时，泻剂结肠组肌条张力明显高于对照组(P＜0.05)。 b.阿片受体激动剂对肌条张力的影响 MOR及KOR均能明显降低泻剂结肠组肌条张力(P＜0.05)，而DOR对肌条张力无明显影响（P＞0.05）;在对照组，MOR、KOR、DOR对结肠张力均无明显影响（P＞0.05）。 c.阿片受体拮抗剂对肌条张力影响 在泻剂结肠组，MOR及KOR拮抗剂均可明显增强肌条张力(P＜0.05)，DOR对肌条张力明显影响(P＞0.05);在对照组，三种阿片受体拮抗剂均对肌条张力影响不明显(P＞0.05)。 结论： 1)泻剂结肠大鼠作为一种操作简便、安全性高、费用相对较低的动物模型，是慢传输型便秘比较理想的研究对像。 2)阿片受体(MOR、KOR、DOR)在泻剂结肠大鼠及慢传输型便秘患者结肠内表达明显增高，提示阿片受体在慢传输型便秘的发病及病程中起着较为重要的作用。 3)阿片受体特异性信号转导蛋白RGS4及β-arrestin2在泻剂结肠大鼠及慢传输型便秘患者结肠的表达亦明显增高，提示这两种信号转导蛋白对阿片受体功能的调节也有相应的变化，对其进行深入的研究也许能揭示阿片受体在慢传输型便秘发病过程中所起的作用。 4)泻剂结肠大鼠结肠肌条在静息状态下自发性张力明显升高，可导致推进性收缩活动减少;MOR、KOR激动剂可导致肌条自发性张力明显降低，MOR、KOR拮抗剂可导致肌条自发性张力增强，提示MOR、KOR在调节泻剂结肠及慢传输型便秘结肠运动功能方面起着比较重要的作用。 5)DOR激动剂及拮抗剂对泻剂结肠组及对照组结肠肌条张力均无明显影响，提示其主要功能主要为影响消化道水电解质的分泌或重吸收。
慢传输型便秘;阿片受体;信号传导蛋白;蛋白表达;病理机制
陆军军医大学
博士
普通外科学
刘宝华
2016
中文
R574.620.2
2020-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）