猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究
猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PRoV)是仔猪常见的重要病毒性腹泻病原，临床上均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征，仔猪的发病率和死亡率较高，给养猪业造成重大经济损失。尤其是PEDV变异株，是近年来仔猪腹泻的主要病原。由于临床症状极其相似，难以区分，只能借助实验室手段加以鉴别诊断。建立PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV快速鉴别检测方法，开展PEDV分子流行病学研究，对仔猪病毒性腹泻的诊断和防控具有重要意义。 1.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV，本研究分别针对PEDVN基因、TGEV M基因、PDCoV N基因和PRoV VP6基因设计特异性引物，经过优化反应条件，建立了同时检测并区分4种病毒的多重RT-PCR方法。结果，该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV，与猪其他主要病毒无交叉反应，具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出下限分别为1.57×102拷贝/μL、1.57×103拷贝/μL、1.57×102拷贝/μL、1.57×102拷贝/μL，具有很高的敏感性;在相同条件下进行重复性试验，获得结果一致。应用所建立的方法检测临床采集的270份腹泻病料，结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56％、11.48％、10.74％、1.85％，并且存在混合感染现象。表明，本研究建立的多重RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 2.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV，分别针对PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和PRoV VP6基因设计特异性引物和TaqMan探针，经过优化反应条件，建立了同时检测并区分4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果，该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV，与猪其他主要病毒无交叉反应，具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出量分别为2.06×102拷贝/μL、2.06×102拷贝/μL、2.06×101拷贝/μL、2.06×103拷贝/μL，具有很高的敏感性;组内与组间重复性试验的变异系数均小于1.1％，具有良好的重现性。应用所建立的方法检测临床采集的243份腹泻病料，结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为11.93％、15.64％、9.05％、9.47％，并且存在混合感染现象。应用上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR方法对相同病料进行检测，结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为10.29％、13.17％、7.82％、7.40％，两者的符合率为96.71％。表明，本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 3.2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究 为掌握广西PEDV流行毒株的遗传变异情况，本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻病料，应用所建立的PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法进行检测，对PEDV阳性样品随机抽取部分样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果，共检测2017-2019年采集的病料1454份，PEDV阳性157份，阳性率10.80％。经扩增、克隆、测序，获得PEDV S基因23株、M基因和N基因各25株。同源性分析表明，广西流行株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因分别为90.7％-100％和85.0％-100％，在M基因分别为97.5％-100％和97.4％-100％，在N基因分别为96.3％-100％和97.1％-100％。序列比对分析表明，广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、变异和插入现象，且广西各毒株之间存在差异。进化速率分析表明，PEDV S基因进化速度最快。基于S、M、N基因绘制遗传进化树，获得相似的拓扑结构图，广西流行毒株在GⅠa、GⅠb、GⅡa、GⅡb亚群均有分布，主要集中在GⅠb、GⅡa亚群。表明，PEDV广西流行毒株均有遗传多样性，应加强病原监测和流行病学调查，为有效防控PED提供基础数据。
仔猪腹泻病毒;鉴别诊断;分子流行病学;聚合酶链式反应
广西大学
硕士
基础兽医学
黎宗强;施开创
2019
中文
S858.28;S855.3
2019-12-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）