内皮细胞中ICAM--1调控FAK表达及其功能研究
炎症是机体抵抗微生物病原体入侵宿主的重要免疫防御反应，是一种为了应对组织损伤，启动多因子化学信号并持续作用于患病组织的宿主反应。该反应涉及白细胞的激活（嗜中性粒细胞，单核细胞和嗜酸性粒细胞）以及其从静脉系统到损伤部位的定向迁移过程。在白细胞的活化以及跨内皮迁移过程中，细胞间粘附分子1（ICAM-1）和黏着斑激酶(FAK)扮演着重要的角色。ICAM-1与活化白细胞上的配体相互作用，激活内皮，从而介导白细胞跨内皮迁移。FAK通过调节黏着斑的翻转进而影响白细胞的跨内皮迁移过程。内皮细胞的ICAM-1与FAK在白细胞跨内皮迁移过程中是如何协调的还不清楚。本实验室已有研究结果表明ICAM-1能够通过miR-15b-5p调控FAK的表达，然而具体的通路机制尚不清楚。为了更好了解内皮细胞中ICAM-1与FAK的协调机制，本论文就miR-15b-5p介导ICAM-1调控FAK表达的机制以及该信号通路对细胞功能的影响开展了研究。主要研究结果如下: 1.在内皮细胞中ICAM-1影响miR-15b-5p的表达选取miR-15b-5p启动子的一段长2049bp的DNA序列，插入到空载质粒pGL3-Control vector中，构建miR-15b-5p双荧光素酶报告载体。以293T细胞为研究模型，进行双荧光实验，实验结果表明ICAM-1能够影响miR-15b-5p的表达。 2.在内皮细胞中ICAM-1促进FAK蛋白表达以b.End.3细胞为研究模型，进行免疫荧光实验。试验共设四组，分别为①Basic;②ICAM-1;③ICAM-1+NC;④ICAM-1+siFAK。与对照组相比，转染ICAM-1使FAK蛋白表达量显著上升;与共转染ICAM-1质粒和control siRNA相比，共转染ICAM-1与siFAK，FAK蛋白表达量显著下降。结果表明ICAM-1正向调控FAK的表达。 3.ICAM-1、miR-15b-5P、FAK影响细胞增殖能力以b.End.3细胞为研究模型，进行CCK-8实验。实验分为两部分，首先初步探究ICAM-1、FAK对细胞增殖能力的影响。试验共设六组，分别为①basic;②ICAM-1;③FAK;④NC;⑤siFAK;⑥ICAM-1+siFAK。实验结果表明ICAM-1、FAK促进细胞的增殖。接下来探究miR-15b-5P对细胞增殖能力的影响。试验共设六组，分别为①basic;②ICAM-1;③ICAM-1+miR-15b-5p mimics;④miR-NC;⑤miR-15b-5p mimics;⑥miR-15b-5p mimics+FAK。实验结果表明miR-15b-5p抑制细胞增殖。 4.超表达FAK促进b.End.3细胞迁移为了进一步探究该信号通路对细胞功能的影响，以b.End.3细胞为研究模型转染FAK质粒，并进行细胞划痕实验。实验结果表明，超表达FAK可显著增强b.End.3细胞的迁移能力。 5.ICAM-1通过miR-15b-5P调控FAK表达的信号通路主要存在于内皮细胞到目前为止，已报道的ICAM-1诱导的信号通路主要存在于内皮细胞，据此本课题提出科学假说:该信号通路主要存在于内皮细胞，并选取A549、HepG2、Hela三种非内皮细胞，以及b.End.3、EA.hy926两种内皮细胞作为细胞模型进行实验。在非内皮细胞A549、HepG2、Hela细胞中超表达和干扰ICAM-1，结果表明细胞中FAK和miR-15b-5p的表达变化不显著;而在内皮细胞EA.hy926和b.End.3细胞中超表达和干扰ICAM-1，结果表明细胞中FAK和miR-15b-5p的表达有显著变化。因而，本课题可以得出结论:miR-15b-5p介导ICAM-1调控FAK表达的信号通路主要存在于内皮细胞。 总之，本课题结果表明在内皮细胞中ICAM-1通过miR-15b-5p正向调控FAK表达，并对细胞迁移和细胞增殖具有促进作用，从而调控机体的炎症反应。该研究为进一步防治过度性炎症反应提供了基础与线索。
炎症反应;内皮细胞;细胞间粘附分子-1;黏着斑激酶;基因表达;调控机制
华中农业大学
硕士
基础兽医学
刘国权
2019
中文
R364.5
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）