Cxcl10(IP--10)/Cxcr3调控巨噬细胞极化和自噬及其功能研究
炎症是对创伤、感染或转化细胞等多种刺激所诱导的组织损伤的应答反应，炎症也是免疫防御必不可少的，而过度炎症会发展成炎症性疾病。巨噬细胞在炎症反应中扮演着重要角色，并展现出高度的表型可塑性，即具有促炎功能的经典激活M1型巨噬细胞和表现抗炎功能的选择替代激活M2型巨噬细胞。因此，M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞间的平衡调控着生理性炎症反应，而打乱这种平衡会导致炎症紊乱。自噬是一种真核细胞中进化上保守的溶酶体降解过程，靶蛋白或细胞器被运送到双层膜的自噬体中，自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，经溶酶体酶降解，参与细胞存活、细胞内稳态、应激反应、先天性免疫和获得性免疫的调控、癌症发生发展等多种细胞过程。巨噬细胞在宿主防御和组织内稳态维持中发挥着能动作用，这就需要在巨噬细胞的促炎和免疫调节功能之间取得微妙的平衡。因此，在确保对环境刺激作出适当的反应方面，巨噬细胞极化所介导的炎症反应和巨噬细胞自噬所调控的溶酶体中氨基酸、胆固醇等营养物质产生之间的相互作用尤显重要。 Cxcl10(IP-10)主要诱导单核细胞和巨噬细胞的趋化反应，与其受体Cxcr3结合后激活这些细胞，并募集效应细胞进入到炎性部位，参与调控多种免疫细胞的迁移、激活和分化，影响获得性免疫、炎症、造血作用和血管生成，并在传染性、自身免疫性、肿瘤性疾病中发挥重要作用。当前，Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴在介导巨噬细胞极化和功能方面还不清楚。因此，本研究旨在探讨Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴是如何影响巨噬细胞极化和自噬的。 (1)Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴调控巨噬细胞极化。在本研究中，分别用巨噬细胞极化典型诱导物IFN-γ、IL-10处理小鼠巨噬细胞RAW264.7，得到了与文献描述一致的实验结果。此外，本研究还证实Mmp9也是巨噬细胞M2极化的标志物。在本研究中发现，IP-10不影响iNOS、Il-1β、Il-6、Il-12βmRNA表达，上调Arg1、Cd163、Mrc1、Mmp9、Vegfa、Pdcd1mRNA表达。ELISA结果显示，IFN-γ诱导Tnf-α的分泌，而IL-10和IP-10不影响Tnf-α的分泌。这表明，IP-10诱导巨噬细胞M2极化。此外，siRNA Cxcr3上调巨噬细胞M1极化标志物Il-1β、Tnf-αmRNA的表达，而巨噬细胞M2极化标志物Arg1、Cd163、Mrc1、Mmp9mRNA表达下调，血管内皮生长因子Vegfa mRNA表达也降低。在本研究中还发现，Cxcr3抑制剂AMG487可以诱导Il-1β、Tnf-αmRNA的表达，抑制Arg1、Cd163、Mrc1、Mmp9、Vegfa、Pdcd1mRNA的表达。这表明，siRNA Cxcr3、Cxcr3抑制剂AMG487可将巨噬细胞极化状态由M2型反转为M1型。 (2)Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴调控巨噬细胞自噬。在本研究中，IP-10上调Arg1、Mmp9、Pdcd1的蛋白表达，因此其很可能参与调控巨噬细胞炎症反应和细胞代谢。然而，应激、饥饿等多种刺激因素又可启动细胞自噬。实验结果显示，IP-10促进巨噬细胞自噬标志物Atg5-Atg12复合物、Lc3-Ⅱ、p62、Lamp1的表达。因此，IP-10可以启动巨噬细胞自噬。另外，Cxcr3抑制剂AMG487可以抑制自噬标志物Lc3-Ⅱ、p62、Lamp1的表达。进一步利用IL-10处理巨噬细胞，结果显示Lc3-Ⅱ、p62表达并没有差异。然而，IP-10却可上调IL-10处理的巨噬细胞Lc3-Ⅱ、p62的表达。因此，这表明IP-10启动M2巨噬细胞自噬。 (3)Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴经由JNK1信号通路介导巨噬细胞极化和自噬。本研究发现，Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴介导JNK1表达;JNK1抑制剂SP600125抑制巨噬细胞Il-1β、Il-6、Tnf-αmRNA的表达，但启动Arg1、Cd163、Mrc1、Vegfa、Mmp9mRNA的表达以及上调Mmp9的蛋白表达。此外，SP600125还可以协同IP-10抑制Il-1βmRNA表达，增强Mrc1、Mmp9mRNA表达。另外，SP600125并不改变巨噬细胞Lc3-Ⅱ、p62、Lamp1的蛋白表达，而其却可协同IP-10增强Lc3-Ⅱ、p62、Lamp1的表达。因此，Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴通过JNK1信号通路介导巨噬细胞极化和自噬的调控。 (4)巨噬细胞极化和自噬相互作用。本研究发现，抑制细胞自噬的siRNA Lamp1可抑制IP-10诱导的M2巨噬细胞Atg5-Atg12复合物、Lc3-Ⅱ、p62的蛋白表达。另外，siRNA Lamp1诱使巨噬细胞M1极化标志物Il-1β、Tnf-αmRNA表达呈现出上调的趋势，而巨噬细胞M2极化标志物Mrc1、Mmp9mRNA无显著变化。然而，siRNA Lamp1协同IP-10促进Il-1β、Tnf-αmRNA的表达。与之相反，siRNA Lamp1抑制IP-10处理下巨噬细胞Mrc1、Mmp9mRNA的表达。此外，siRNA Lamp1还抑制IP-10处理下巨噬细胞Arg1的蛋白表达。由此表明，细胞自噬可能调控巨噬细胞的极化，而IP-10则通过JNK1/Lamp1信号通路以介导巨噬细胞极化和自噬之间的相互作用。 (5)Cxcl10(IP-10)/Cxcr3轴影响血管生成。趋化因子在很大程度上协调了组织修复过程，该过程涉及受伤后的止血和炎症、增殖和血管生成，以及新生组织的重塑。本研究最后分别收集IP-10、Cxcr3抑制剂AMG487处理的巨噬细胞条件培养液，并用该培养液继续培养划痕后的血管内皮细胞b.End.3。结果显示，与对照组相比较，各实验组均不同程度地促进创伤愈合。IP-10处理组愈合程度最明显，而AMG487处理组和对照组的愈合程度低于IP-10处理组。 总之，以上结果表明IP-10可能通过其受体介导的信号通路调控巨噬细胞自噬，并随后调控巨噬细胞极化。IP-10对巨噬细胞自噬和极化的调控，可能最终影响炎症造成损伤的血管内皮细胞的修复。
巨噬细胞;极化效应;细胞自噬;CXC族趋化因子配基10;炎症反应
华中农业大学
博士
基础兽医学
刘国权
2019
中文
R392.12
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）