T--2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究
T-2毒素是由镰刀菌(Fusarium)产生的一种次级代谢产物，也是A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种。T-2毒素在自然界中分布非常广泛，在田间生长的作物如大麦、小麦、燕麦、黑麦和玉米，以及储存的谷物都是T-2毒素的污染对象。动物在摄入污染了T-2毒素的饲料后能引起多种毒性作用，肠道和肝脏对T-2毒素尤其敏感。T-2毒素能够降低动物的食欲和增重，引起严重的经济损失。T-2毒素还可能通过食物链进入人们的餐桌，因此对动物和食品动物消费者的健康都具有较大的威胁。 T-2毒素对食品动物的一个重要毒性作用是生长抑制效应。动物在长期低剂量摄入T-2毒素污染的饲料后会引起慢性毒性作用，包括食欲不振、生长发育迟缓、体重降低等，并导致动物饲料利用率明显降低，给养殖业带来巨大的经济损失。虽然目前对T-2毒素引起的动物生长抑制有一定的研究，但总的来说，T-2毒素对动物生长抑制的作用机制还不清楚。研究表明T-2毒素可能通过改变大脑中五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平，降低动物的食欲;或者通过抑制动物肠上皮细胞的增殖，损害肠道微绒毛，导致肠道营养吸收受阻。本实验室前期对T-2毒素的生长抑制效应也做了研究，结果表明，T-2毒素对生长激素(Growth hormone，GH)的合成和分泌抑制可能是该毒素导致动物生长抑制的一个重要因素。另外，T-2毒素还能够损伤血脑屏障功能，增加其通透性，从而进入大脑并引起垂体的病理损伤。目前虽然观察到了T-2毒素引起的垂体损伤，但是其中的损伤机制还不清楚。 氧化应激是指细胞中线粒体或其他来源的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)产生过量而不能有效被清除，改变了细胞内氧化还原平衡（倾向于氧化)，引起的一系列氧化损伤。研究表明，T-2毒素能够导致不同细胞中ROS显著增加，并引起氧化应激。由于线粒体呼吸链产生了细胞中超过90％的ROS，T-2毒素引起氧化应激的同时还伴随着线粒体功能损伤。本课题以线粒体功能变化和氧化应激为切入点，选用大鼠垂体前叶GH3细胞为模型（该细胞是研究动物生长抑制的经典细胞模型），深入研究T-2毒素在GH3细胞上引起的线粒体功能变化和氧化应激发生情况，以及更深层次的，T-2毒素是如何诱导线粒体功能变化。 1.T-2毒素诱导GH3细胞线粒体功能变化和氧化应激研究 本研究首先通过CCK-8实验确定了T-2毒素在GH3细胞中的IC50约为15.67nM，在确保T-2毒素对细胞产生一定毒性，并保持一定的细胞存活率情况下，分别采用低剂量和高剂量(10和40nM)T-2毒素孵育GH3细胞24h，检测细胞内氧化应激和线粒体功能各项参数。结果表明，T-2毒素处理GH3细胞后显著增加细胞内ROS和线粒体超氧自由基含量，ROS不仅消耗了细胞内的还原物谷胱甘肽(GSH)，还增加了DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量。T-2毒素在诱导氧化应激的同时，还激活了细胞抗氧化系统，包括增加抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性，上调编码抗氧化酶的基因GPx-1、SOD-2、CAT、Ucp-1、Ucp-2和Ucp-3的表达水平，其中CAT和Ucp-3的表达水平上调了53倍和86倍，表明T-2毒素显著激活了这些抗氧化基因的表达，来抵抗氧化应激引起的损伤效应。 本研究结果还表明10nM和40nM T-2毒素孵育GH3细胞24h后，显著增加线粒体ATP水平和呼吸链复合物Ⅰ活性。T-2毒素也增加了呼吸链中编码铁硫蛋白、黄素蛋白和血红素蛋白的基因表达，以及调控线粒体生物合成的转录/激活因子表达（如PGC-1家族成员、核呼吸因子和线粒体转录因子Tfam、Tfb1m和Tfb2m)，这些变化可能源于T-2毒素诱导线粒体应激反应后的一种线粒体功能补偿效应。 2.Ndufs3在T-2毒素诱导的线粒体功能变化中的作用研究 本研究在GH3细胞中分别沉默和过表达Ndufs3，再利用40nM T-2毒素孵育GH3细胞24h，检测线粒体超氧自由基水平、复合物Ⅰ活性、线粒体△Ψm和ATP水平。结果表明，在GH3细胞中沉默Ndufs3能够显著抑制复合物Ⅰ活性，降低线粒体AΨm，也能一定程度增加超氧自由基含量，降低ATP水平;而在加入T-2毒素后，沉默Ndufs3能进一步显著增加超氧自由基产生，降低复合物Ⅰ活性和线粒体△Ψm，说明Ndufs3表达缺陷能够引起线粒体功能障碍，也会增加GH3细胞对T-2毒素易感性，使线粒体更容易受到T-2毒素损伤。 本研究在GH3细胞中过表达Ndufs3后，利用40nM T-2毒素孵育细胞24h，检测线粒体变化。结果表明，过表达Ndufs3后，线粒体复合物Ⅰ活性、超氧自由基水平、线粒体△Ψm和ATP水平都没有明显变化;而在加入T-2毒素后，过表达Ndufs3对这些参数也没有明显改变，表明在GH3细胞中过表达Ndufs3后加入T-2毒素处理，并不会对线粒体功能提供明显保护作用。 3.核呼吸因子2在T-2毒素诱导线粒体功能变化中的作用研究 本研究首先确定T-2毒素孵育GH3细胞0、2、4、6、8和12h后，NRF-2的亚细胞定位和表达情况，结果表明NRF-2在所有时间点都一直位于细胞核中，这与NRF-2作为转录因子在细胞核发挥作用的属性是相符的。10nM和40nMT-2毒素孵育GH3细胞24h后，NRF-2的基因和蛋白表达水平都显著增加，具有浓度依赖性，表明T-2毒素能够诱导NRF-2表达。 本研究通过RNA干扰沉默NRF-2后，利用40nM T-2毒素孵育24h，检测线粒体ROS含量、ATP水平、复合物Ⅰ活性、mt-DNA拷贝数变化，结果表明，在GH3细胞中沉默NRF-2能够一定程度增加ROS含量、降低ATP水平，抑制mt-DNA拷贝数和复合物Ⅰ活性;沉默NRF-2并加入T-2毒素处理后则能更大程度地增加ROS含量和抑制mt-DNA拷贝数，并逆转T-2毒素诱导的ATP水平和复合物Ⅰ活性增加，并且具有显著性，这些结果表明NRF-2确实参与调控了T-2毒素诱导的线粒体功能变化，而NRF-2能够促进GH3细胞线粒体功能。 4.T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬研究 为了深入研究T-2毒素是否能够激活GH3细胞自噬和线粒体自噬，为细胞提供保护作用，本研究首先利用双荧光标记的自噬标志物LC3(mRFP-eGFP-LC3)和mKeima荧光蛋白标记的线粒体(Mito7-mKeima)确定T-2毒素能否诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬。通过腺相关病毒在GH3细胞中稳定表达mRFP-eGFP-LC3蛋白，利用10和40nM T-2毒素孵育细胞24h，通过共聚焦显微镜观察细胞自噬。结果表明，T-2毒素处理GH3细胞24h后，细胞内形成了明显的LC3自噬斑点，而对照组荧光均匀分布于细胞质中，表明T-2毒素能够诱导GH3细胞自噬。40nM T-2毒素处理细胞后，有的自噬小体已经形成了下一阶段的自噬溶酶体。通过慢病毒在GH3细胞中稳定表达Mito7-mKeima融合蛋白，利用10和40nM T-2毒素处理细胞24h，通过荧光显微镜观察线粒体自噬。结果表明，10和40nM T-2毒素处理细胞后，mKeima蛋白的红色荧光强度明显增加，表明T-2毒素也能够诱导GH3细胞线粒体自噬。电镜结果也显示，T-2毒素处理的GH3细胞中能够观察到膜结构包裹的异常线粒体，可以判断这是T-2毒素处理细胞后形成的线粒体自噬体。 为了确定线粒体自噬是否能够保护GH3细胞线粒体功能，并降低T-2毒素诱导的细胞凋亡。本研究在GH3细胞中沉默线粒体自噬基因Pink1和NIX来抑制线粒体自噬活性，然后用T-2毒素处理细胞，检测线粒体融合与分裂基因Drp-1、Fis-1和Mfn-1表达、线粒体ATP水平和细胞凋亡。结果表明，10和40nMT-2毒素孵育细胞24h后，Drp-1、Fis-1和Mfn-1基因表达都呈浓度依赖性增加，ATP水平也显著增加，并诱导了细胞凋亡。但是，在GH3细胞中沉默Pink1或NIX，或同时沉默Pink1和NIX都能显著降低T-2毒素诱导的Drp-1、Fis-1和Mfn-1基因上调和ATP增加，并显著增加T-2毒素诱导的细胞凋亡，说明抑制线粒体自噬能够抑制线粒体融合与分裂活动和线粒体能量产生，也能促进细胞死亡。 综上所述，本文研究了T-2毒素在GH3细胞诱导的线粒体氧化应激、线粒体结构和功能变化、呼吸链核心铁硫蛋白亚基Ndufs3和线粒体生物合成调控因子NRF-2在T-2毒素引起的线粒体功能变化中的作用、T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬以及线粒体自噬在线粒体功能和细胞存活中的作用。本文从线粒体的角度，为T-2毒素引起的动物生长抑制的分子机制提供了新的依据。
兽医学;T-2毒素;线粒体;氧化应激;细胞自噬;毒性作用
华中农业大学
博士
基础兽医学
袁宗辉
2019
中文
S859.8
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）