ErmB突变对其甲基化活性和最低抑菌浓度的影响
自第一代大环内酯类抗生素红霉素问世以来，由于其对革兰氏阳性菌良好的治疗效果而广泛应用。但由于滥用，导致大部分抗生素不能完全被机体吸收，高达百分之八十五的抗生素以原形或者代谢物排出体外。久而久之，日益严重的细菌耐药性问题随之而来。引起大环内酯类抗生素高水平耐药的重要机制有erm(B)基因编码的核糖体甲基化、由mef(A)基因编码的大环内酯外排作用和rRNA和核糖体蛋白内的突变，其中由erm(B)编码的核糖体甲基化是中国，斯里兰卡和韩国最常见的红霉素抗性机制。有研究结果表明，erm能够促使细菌核糖体发生甲基化或二甲基化，被甲基化后的细菌核糖体结构发生改变，与大环内酯结合的空间位点被隐藏，导致大环内酯类抗生素不能与细菌结合从而引起耐药。但erm甲基转移酶介导大环内酯耐药的详细机制并不清楚，尤其是erm甲基转移酶中哪些氨基酸残基介导erm甲基化、相比于野生型(WT)erm甲基转移酶突变菌株甲基化程度与最低抑菌浓度的关系、突变后的氨基酸对大环内酯类耐药贡献如何，国内外研究中均未见报道。 本实验室前期研究从兽医临床发病或死亡雏鸭脾脏和脑中分离得到6株解没食子酸链球菌巴氏亚种（S.gallolyticus subsp,pasteurianus），发现这些分离株的高水平大环内酯耐药是由大环内酯耐药基因ermB和erm T同诱导表达导致。在生物信息学分析基础上，前期研究已经构建了ermB的32个突变菌株。本研究利用微生物学及药理学手段，根据美国临床和实验室标准委员会(CLSI)M07-A9号文件推荐的方法进行实验。用琼脂平板法和微量肉汤稀释法检测WT ermB和含有这些突变体的细菌对大环内酯类及林可酰胺类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)值。选红霉素(Ery)和克拉霉素(Cla)作为大环内酯类抗生素的代表药物，选林可霉素(Lin)作为林可酰胺类抗生素的代表药物;选取WT ermB和两株MIC值较WT ermB升高(K40A、E58D)，两株MIC值较WT ermB没有明显变化(K188A、K196A)，三株MIC值较WT ermB下降(D60E、R139A、K165A)共8株菌株进行蛋白提取并将提取的蛋白进行纯化浓缩;提取MBP-MS2蛋白并进行纯化浓缩;利用Rachel Green实验室报道的MS2系统亲和纯化核糖体的方法提取核糖体23S rRNA，并检测WT ermB及其突变菌株的甲基化活性，利用生物化学的手段，对核糖体的甲基化活性进行探索。研究结果如下: 1.用琼脂平板法初筛检测ermB、ermB突变菌株的MIC值 参考美国临床和实验室标准委员会(CLSI)推荐的方法进行实验，利用琼脂平板法分别对WT ermB和ermB突变菌株进行MIC的初筛。初筛实验结果表明:与WT ermB对红霉素MIC（512μg/mL）值相比，突变菌4株较敏感，它们分别是E58A、D60E、R139A和K165A;与WT ermB对克拉霉素MIC（512μg/mL）值相比，突变菌4株较敏感，它们分别是D60E、R76A、R139A和K165A;与WT ermB对林可霉素MIC(512μg/mL)值相比，突变菌4株较敏感，它们分别是E35A、D60E、E116A和E127A。 2.用微量肉汤稀释法检测WT ermB、ermB突变菌株的MIC值 首先验证质控菌金黄色葡萄球菌ATCC29213检测配制的药物的可靠性，检测符合标准的药物方可进行试验。选用以上三种抗生素，抗生素利用二倍稀释法稀释，浓度梯度(μg/mL)为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5。精筛结果表明:与WT ermB对红霉素MIC(1024μg/mL)值相比，突变菌4株较敏感;与WT ermB对克拉霉素MIC（512μg/mL）值相比，突变菌6株较敏感;与WT ermB对林可霉素MIC(1024μg/mL)值相比，突变菌3株较敏感。其中突变菌株R139A对红霉素、克拉霉素、林可霉素三种抗生素的MIC值分别为32μg/mL、16μg/mL、512μg/mL;突变菌株K165A对红霉素、克拉霉素、林可霉素三种抗生素的MIC值分别为64μg/mL、32μg/mL、512μg/mL;突变菌株D60E对红霉素、克拉霉素、林可霉素三种抗生素的MIC值分别为128μg/mL、128μg/mL、256μg/mL;突变菌株K40A和E58D的MIC值基本增大;突变菌株K188A和K196A的MIC值基本不变。 3.对ermB蛋白的表达条件进行优化 对ermB蛋白的表达条件进行优化，选择温度分别为25℃和37℃，诱导剂IPTG浓度分别为0.4mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L进行试验。结果表明，在温度为37℃时，无论IPTG浓度高低，蛋白几乎均在沉淀表达，在上清中表达量较少。而温度为25℃，IPTG浓度为1mmol/L时，上清表达量相对较高，所以用25℃，IPTG浓度为1mmol/L进行后续的蛋白提取。测定ermB突变菌对三种抗生素MIC值后，选取WT ermB和两株MIC值较WT ermB升高、两株MIC值较WT ermB没有明显变化、三株MIC值较WT ermB下降共8株突变菌株进行蛋白提取并将提取的蛋白进行纯化浓缩，用12％的SDS-PAGE鉴定。 4.提取S.gallolyticus subsp,pasteurianus23S rRNA并纯化 采用Rachel Green实验室报道的利用MS2系统亲和纯化核糖体的方法。首先分离纯化MBP-MS2蛋白，浓缩后用于S.gallolyticus subsp,pasteurianus23S rRNA的提取。大量破碎的S.gallolyticus subsp.Pasteurianus和核糖体纯化缓冲液B一起经过密度梯度离心后发生沉淀，将沉淀稀释后加入结合有MBP-MS2蛋白的麦芽糖标签的层析柱，用核糖体洗脱缓冲液D洗脱，收集洗脱液，浓缩后跑12％尿素胶鉴定。 5.WT ermB及ermB突变菌株的甲基化酶活性检测与分析 将用3H标记的S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，解没食子酸链球菌核糖体23S rRNA作为甲基化底物，对WT ermB及ermB突变菌株的甲基化酶活性进行检测。检测结果表明:突变菌株D60E、R139A、K165A甲基化酶活性低于WT ermB甲基化酶活性;突变菌株K40A和E58D的甲基化酶活性高于WT ermB甲基化酶活性;突变菌株K188A、K196A的甲基化酶活性与WT ermB甲基化酶活性略有降低但基本不变; 结论:突变菌株与WT ermB的MIC值相比，对大环内酯类红霉素MIC值降低的突变菌株分别为:E58A、D60E、R139A、K165A;对大环内酯类克拉霉素MIC值降低的突变菌株分别为:D60E、R76A、R139A、K165A和E201A;对林可酰胺类林可霉素MIC值降低的突变菌株分别为:E35A、D60E、E116A、E127D。 分别测WT ermB和突变菌株D60E、R139A、K165A、K40A、E58D、K188A、K196A的酶活性。结果显示突变菌株D60E、R139A、K165A获得的酶活性小于WT ermB原有的酶活性，突变菌株K40A、E58D获得的酶活性大于WT ermB原有的酶活性，突变菌株K188A、K196A获得的酶活性略小于WT ermB原有的酶活性，该结果与MIC值的变化趋势基本一致。所以第60、139、165位氨基酸的突变对ermB甲基化酶活性影响较大，间接的影响大环内酯耐药。本研究通过测MIC值和ermB甲基化活性并比较两者的内在关系，揭示了erm基因（ermB在大环内酯耐药中的作用机制以及ermB蛋白与核糖体23S rRNA结合对大环内酯耐药的贡献，为解决因核糖体甲基化而导致的大环内酯耐药提供了新方向，为抗菌增效剂的研发提供了理论基础。
兽用药物;抗菌增效剂;ermB蛋白;甲基化活性;抑菌浓度
华中农业大学
硕士
基础兽医学
刘翠平;吴健
2019
中文
S859.79
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）