CXCR1/2在猪肺炎中的表达分析及其拮抗蛋白的制备
医学研究表明CXCR1和CXCR2(CXCR1/2)及其配体CXCL8在多种疾病中发挥重要的调节作用。为分析猪CXCR1/2在肺炎中的表达，研发新型兽用抗炎药，本研究表达了猪CXCR1/2蛋白，制备了多克隆抗体，通过荧光定量PCR(qPCR)和免疫组织化学技术(IHC)分析了猪CXCR1/2在间质性肺炎、支气管肺炎、化脓性肺炎、纤维素性肺炎和浆液性肺炎中的表达情况，并在此基础上表达了猪CXCR1/2拮抗蛋白CXCL8(3-72)N11R/G31P(pN11R)和CXCL8(3-72)G31P(pG31P)，通过细胞趋化实验和动物实验评价了它们的抑炎效果，拟为研发新型兽用抗炎药提供科学依据，主要研究内容如下: 1、样品收集 2017年3月至2018年12月共收集猪肺炎样品136例，包含间质性肺炎81例，支气管肺炎17例，化脓性肺炎21例，浆液性肺炎8例，纤维素性肺炎9例。 2、猪不同类型肺炎中CXCR1/CXCR2mRNA的表达分析 通过qPCR方法检测不同肺炎组织中CXCR1和CXCR2的表达量。结果显示:与正常肺组织相比，5种类型肺炎样本中肺组织CXCR1/2mRNA的表达量均极显著上调，其中CXCR1mRNA的表达量显著高于CXCR2mRNA的表达量。CXCR1/2mRNA在纤维素性肺炎、支气管肺炎以及化脓性肺炎样本中的表达量显著高于间质性肺炎和浆液性肺炎的表达量。 3、猪CXCR1/CXCR2重组质粒的构建与蛋白的表达、纯化 通过RT-PCR扩增CXCR1和CXCR2基因，并克隆至pGEX-6p-1载体，构建重组质粒PCXCR1和PCXCR2。将重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)中，表达重组蛋白。蛋白经纯化系统AKTA prime10纯化后，SDS-PAGE及Western-blot检测结果显示蛋白纯化效果较好。 4、猪CXCR1/2在不同类型肺炎中的表达与分布 猪重组CXCR1/2蛋白免疫小鼠后制备多克隆抗体，利用IHC技术检测CXCR1/2在不同类型肺炎样本中的分布与表达。结果显示，CXCR1/2在支气管上皮细胞和肺组织浸润的中性粒细胞的胞浆和胞膜上呈阳性表达，5种类型肺炎样本中CXCR1/2的表达量较对照组均显著上调，除浆液性肺炎外，其余4种类型肺炎样本中CXCR1的表达量均显著高于CXCR2，且CXCR1/2在支气管肺炎、化脓性肺炎和纤维素性肺炎样本中的表达量显著高于间质性肺炎和浆液性肺炎，与qPCR检测结果相一致。由此推断CXCR1/2的表达与组织中中性粒细胞的浸润程度呈正相关，CXCR1可能在诱导中性粒细胞参与猪肺炎调节中起到主要作用。 5、猪CXCR1/2拮抗蛋白对中性粒细胞趋化作用的影响 制备猪CXCR1/2拮抗蛋白pN11R和pG31P;分离猪外周血中性粒细胞，建立琼脂糖趋化模型，通过检测中性粒细胞定向迁移距离，判定pN11R和pG31P对体外中性粒细胞趋化的影响。结果显示:pN11R和pG31P诱导中性粒细胞定向迁移的能力较pCXCL8显著降低。 6、猪CXCR1/2拮抗蛋白对LPS诱导的小鼠肺炎模型抑炎效果的评价 16-18g雌性BALB/c小鼠随机分成5组;其中1组滴鼻接种20μL灭菌生理盐水作为对照组;另外4组滴鼻接种LPS诱导小鼠肺炎(10μL/10μg/只)，同时分别滴鼻接种生理盐水10上L(LPS组)、pCXCL8蛋白10μL(CXCL8组)、pN11R蛋白10μL(N11R组)和pG31P蛋白10μL(G31P组)。24h后，小鼠实施安乐死，并进行肺组织病理学检查、髓过氧化物酶(MPO)和炎症因子检测，肺泡腔灌洗液(BALF)中性粒细胞计数，评价猪CXCR1/2拮抗蛋白对小鼠肺炎的治疗作用。结果显示:与LPS组和CXCL8组相比，N11R组和G31P组小鼠肺组织炎症明显减轻，肺组织MPO活性与炎症因子CXCL1、TNF-α和CXCL8的表达以及BALF中性粒细胞计数也显著降低，其中G31P组小鼠肺组织MPO活性、BALF中性粒细胞计数和TNF-α的表达量显著低于N11R组。 研究表明，猪CXCR1/2主要在支气管上皮细胞和肺组织中的浸润的中性粒细胞的胞浆和胞膜上呈阳性表达，其表达量与组织中中性粒细胞的浸润程度呈正相关。CXCR1可能在诱导中性粒细胞参与猪肺炎调节中起到主要作用。猪CXCL8(3-72)N11R/G31P和CXCL8(3-72)G31P可以通过降低CXCL8表达、抑制中性粒细胞迁移，显著减轻LPS诱导的小鼠肺部炎症，对肺炎具有一定的抑制作用，其中CXCL8(3-72)CXCL8G31P的抑炎效果更好。
猪肺炎;拮抗蛋白;炎症反应;抗炎作用
华中农业大学
硕士
基础兽医学
张万坡
2019
中文
S858.28:S856.3;S859.792
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）