尘肺差异表达microRNA筛选的初步研究
目的: 通过分析矽肺动物模型不同时期肺组织中miRNA表达谱的变化，筛检并验证与矽肺发生发展密切相关的miRNAs;并在细胞水平和矽肺患者血清中进一步验证差异表达的miRNA，探索miRNA作为矽肺早期生物标志物的应用价值。 方法: 将雄性Wistar大鼠随机分为1、7、14、21、28d对照组和二氧化硅(SiO2)染尘组，每组6只，采用一次性非暴露式气管滴注法灌注1ml SiO2悬浊液建立大鼠SiO2染尘组，对照组大鼠以相同方法气管内注入1ml灭菌生理盐水。分别于染尘后相应时间点采集各组大鼠肺组织，其中3只大鼠取出肺组织进行病理学观察，另外3只采用miRNA微阵列芯片技术筛选肺组织中差异表达的miRNA，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法验证差异表达的miRNA在两组间大鼠肺组织中的表达水平，对两组中差异表达的miRNA进行靶基因预测并进行GO富集分析和KEGG通路分析。 在体外细胞水平中培养A549细胞，分为对照组、SiO2刺激组和TGF-β1刺激组，RT-qPCR法验证A549细胞中miRNA的表达水平，然后选择山东省职业卫生与职业病防治研究院就诊的Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期矽肺患者各18例，健康对照组选取某医院健康查体人员18例，均为男性，采用RT-qPCR法验证miRNA在矽肺患者和健康对照者血清中的表达水平。应用SPSS22.0统计软件对计量资料及病理半定量资料结果进行分析。 结果: 1.动物一般情况 模型组大鼠出现呼吸急促、体重增长缓慢等现象。造模后第28d解剖发现，对照组大鼠肺组织呈正常的粉红色，大小正常，弹性好;而模型组大鼠肺脏偏白色，明显增大，弹性较差，肉眼可见灰白色结节状病灶，触之有沙砾感。造模后两组大鼠体重均有所增加，模型组大鼠第14、21和28d体重增长速度明显低于对照组，21、28d模型组与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。模型组大鼠的肺脏重量和肺系数较对照组大鼠增加显著，在第1、7、14、21和28d五个时间点差异均有统计学意义（P＜0.01）。 2.组织病理学检查 光学显微镜观察显示，对照组大鼠HE染色可见肺组织结构清晰;1、7和14d HE染色可见，染尘组大鼠肺组织内有以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润;21、28d HE染色可见，肺组织肺泡结构不清，局部可见少量坏死的细胞，其内成纤维细胞明显增多。对照组和1、7、14d染尘组大鼠Masson染色均未发现明显胶原纤维;21、28d Masson染色可见，染尘组大鼠肺间质可见大片状密集的胶原纤维沉积，在局部肉芽组织、支气管及血管壁周围胶原蛋白增生明显。 3.肺组织miRNA芯片检测结果 五个时间点染尘组与相应对照组大鼠肺组织miRNA芯片检测结果相比，共筛选出144个差异的miRNA，其中63个表达水平明显上调，81个表达水平明显下调。差异表达的miRNA可能调控着与炎症、基因转录、细胞周期及信号转导相关的基因表达。差异miRNA靶基因的功能主要与蛋白结合、凋亡过程和以DNA为模板的转录有关，且主要集中在细胞质和细胞外泌体上发挥作用。并且相关靶基因通过参与TGF-β和PI3K-AKT信号通路而影响细胞的增殖和凋亡等，在肺纤维化的发生发展中发挥作用。 4.RT-qPCR验证miRNA芯片结果 分别取芯片中下调表达较明显的miR-29b-3p、miR-34c-3p、let-7d-3p、miR-672-5p、miR-582-3p和miR-26a-5p，和上调表达较明显的miR-21-3p、miR-423-5p、miR-3544、miR-542-3p、miR-155-5p和miR-146-5p进行RT-qPCR验证，与对照组相比，染尘组中的miR-29b-3p、miR-34c-3p、let-7d-3p和miR-26a-5p表达水平均显著下调（P＜0.05），miR-21-5p、miR-423-5p表达水平均显著上调（P＜0.05）。 5.miRNAs在A549细胞中的相对表达量 分别于12、24和48h后收集细胞，提取总RNA进行RT-qPCR验证，与12h组相比，24和48h组中miR-29b-3p和miR-34c-3p表达水平均显著下调，miR-155-5p表达水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。 6.肺通气功能测试及血清miRNA的表达分析 四个指标在Ⅱ期和Ⅲ期矽肺中全部异常，在对照组和Ⅰ期矽肺中表达正常。RT-qPCR显示miR-155-5p、miR-21-5p在病例组中的表达量高于对照组（P＜0.05），miR-26a-5p、miR-34c-3p、miR-29b-3p在病例组中的表达量低于对照组（P＜0.05）。并且miR-21-5p的表达水平在对照组以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺中表达递增，miR-34c-3p、miR-29b-3p的表达水平在对照组以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺中表达递减。 结论: 1.染矽尘大鼠动物模型中发现6种与肺纤维化发生发展密切相关的miRNAs，其中上调的miRNA为miR-21-5p和miR-423-5p，下调的miRNA为miR-29b-3p、miR-34c-3p、let-7d-3p和miR-26a-5p;差异表达的miRNA调控着与炎症、凋亡、细胞周期、基因转录和信号转导相关的基因。 2.在SiO2和TGF-β1处理的A549细胞中miR-29b-3p和miR-34c-3p表达水平均显著下调，miR-155-5p表达水平显著上调，这表明这3种基因可能调控肺纤维化的发生发展;在矽肺患者血清中miR-21-5p的表达水平在对照组以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺中表达递增，miR-34c-3p、miR-29b-3p的表达水平在对照组以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺中表达递减，这3种miRNA可能提示疾病的进程。 3.miR-21-5p在矽肺大鼠肺组织和矽肺患者血清中表达水平均显著上调，miR-29b-3p和miR-34c-3p在矽肺大鼠肺组织、染矽尘A549细胞和矽肺患者血清中表达水平均显著下调，表明这三种miRNA可能调控肺纤维化的发生发展，有望成为早期矽肺诊断以及预后的指标。
尘肺;病理机制;微小核糖核酸;差异表达
济南大学
硕士
劳动卫生与环境卫生学
邵华
2019
中文
R563.902
2019-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）