基于PGEA的基因载体介导CRISPR/Cas9体内递送在心血管领域的应用研究
CRISPR/Cas9作为一种新兴的基因编辑工具已经被广泛的应用于体内和体外的基因编辑，包括致病基因的纠正、功能基因的验证等。然而由于CRISPR/Cas9的大尺寸，如何安全有效的实现体内递送仍然是限制其进一步发展为人类体内应用的障碍。病毒载体往往受限于其免疫原性和包装能力，非病毒载体由于其灵活性得到越来越多的关注，但是也受到较低的转染效率和较高毒性的制约。虽然多种CRISPR/Cas9系统的递送载体实现在肿瘤疾病中的应用，但是在心血管疾病中的应用微乎其微。普鲁兰糖或者胆固醇功能化的PGEA载体在基因递送方面显示出巨大的潜力。针对以上问题，本论文基于PGEA的基因载体实现有效的CRISPR/Cas9系统递送用于心血管疾病领域。 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9(Pcsk9)主要表达在肝脏和小肠组织，是治疗和预防冠心病的重要靶点。目前临床上已经有Pcsk9的单克隆抗体用于冠心病的治疗，但是价格昂贵，需要重复给药。通过CRISPR/Cas9系统实现对Pcsk9的基因编辑同时降低全身给药的副作用将为冠心病的治疗提供一种策略。基于此构建了普鲁兰修饰的PGEA(Pul-PGEA)作为CRISPR/Cas9系统的递送载体。普鲁兰多糖具有肝脏靶向性，降低了全身给药的副作用。Pul-PGEA在体内和体外都体现出了优良的CRISPR/Cas9转染性能和基因编辑能力，能够明显降低血浆Pcsk9和总胆固醇水平。同时Pul-PGEA也显示出递送短链mimic-cy3和长链Cas9mRNA的巨大潜力。 Fbn1的突变往往与动脉瘤的发生是相关的，因此快速的鉴定新发现的位点变异是致病性还是良性对于随后的诊断和治疗显得非常迫切。由于完整的血管内皮屏障，将CRISPR/Cas9系统有效递送至主动脉血管系统仍然是遗传性血管疾病的体内基因编辑的挑战。在第三章中，报道了具有丰富羟基的胆固醇修饰的CHO-PGEA可以递送基于质粒的pCas9-sgFbn1系统，用于Fbn1的基因编辑。这是聚阳离子介导的CRISPR/Cas9系统在成年小鼠主动脉中进行基因编辑的第一份报告。CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1纳米系统可有效促进体外血管平滑肌细胞Fbn1中外显子10的敲除，从而导致Smad2/3磷酸化的改变和Fbn1两个下游靶基因的表达增加。对于体内应用，通过施用一定剂量的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)实现CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1的主动脉血管上的富集，从而产生有效的基因编辑。因此，CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1纳米系统与AngⅡ输注的组合可提供在主动脉中进行体内基因编辑的可能性。
心血管疾病;临床治疗;基因编辑;体内递送;基因载体
北京化工大学
硕士
材料科学与工程
杜杰
2019
中文
R540.5
2019-09-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）