麝香酮对MCAO大鼠内源性神经干细胞增殖与分化作用机制的研究
目的: 卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率等特性，是欧美国家第二大死亡原因，在中国，卒中是人类死亡的最主要原因，急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)约占全部卒中的80％。目前卒中的研究聚焦于如何高效的修复AIS后神经损伤。以前人们往往觉得大脑中的神经元是不具备再生能力的。神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)的发现为神经修复带来新希望。开窍醒神中药麝香广泛用于缺血中风治疗，但其促进神经再生的机制尚不明确。本研究运用脑缺血/再灌注(MCAO)模型，采用分子生物学、干细胞等技术，观察“开窍醒神”法对于内源性NSC增殖分化的影响，分析“开窍醒神”法干预内源性NSC增殖分化的分子机制，揭示中医“开窍醒神”法实质，丰富中医治疗中风病的理论。 方法: 1.实验动物 SPF级雌性SD大鼠90只，体重250-300g，按随机数字表分为6组，高、中、低浓度组各24只，再分为1、3、7、14d组，假手术组、模型组、空白对照组各6只。模型组、假手术组、空白对照组给予生理盐水灌胃，麝香酮高、中、低剂量组分别给予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg灌胃，按10ml/kg体重的体积灌胃给药，每日灌胃1次。 2.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N蛋白表达的影响 复制大鼠MCAO模型，高(16.8μL/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μL/100g)剂量麝香酮混悬液连续灌胃1d、3d、7d、14d后处死，分离侧脑室下区(subventricular zone，SVZ)脑组织，蛋白质免疫印迹法检测神经元特异性核蛋白Neu-N、胶质纤维酸性蛋白GFAP蛋白表达，用Image Lab显影成像并进行数据分析，比较分析各组大鼠蛋白表达的差异。 3.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N细胞增殖分化的影响 复制大鼠MCAO模型，高(16.8μL/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μL/100g)剂量麝香酮混悬液连续灌胃1d、3d、7d、14d后处死，分离侧脑室下区脑组织，多聚甲醛固定、包埋及切片后进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察，分析各组大鼠神经元标志物Neu-n、星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞计数的表达差异。 结果: 1.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N蛋白表达的影响 蛋白印迹结果提示，在MCAO大鼠SVZ区发现有GFAP、Neu-N蛋白的增殖，与模型组比较，中高浓度组GFAP、Neu-N蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.01)，可见不同浓度的麝香酮作用于MCAO大鼠，GFAP蛋白表达随药物浓度的递增而呈递减趋势，Neu-N蛋白表达随药物浓度的递增而呈递增趋势。在MCAO大鼠侧脑室发现有GFAP、Neu-N蛋白的沉积;麝香酮呈浓度依赖性下调MCAO大鼠侧脑室GFAP蛋白表达;麝香酮呈浓度依赖性上调MCAO大鼠侧脑室Neu-N蛋白的表达。 2.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N细胞增殖分化的影响 结果显示，星形胶质细胞计数依次为:高浓度麝香酮组(33.67±5.86)个/视野、中浓度麝香酮组(39.67±5.13)个/视野、低浓度麝香酮组(55.33±2.31)个/视野、模型组(50.67±2.08)个/视野、假手术组(56.33±9.0)个/视野、空白对照组(58.33±1.53)个/视野，与空白对照组比较，模型组、低浓度麝香酮组大鼠星型胶质细胞激活计数明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组大鼠比较，中高浓度麝香酮组大鼠的星形胶质细胞激活数显著减少，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。神经元细胞计数依次为:高浓度麝香酮组(110.67±37.2)个/视野、中浓度麝香酮组(91.33±36.95)个/视野、低浓度麝香酮组(69.33±20.79)个/视野、模型组(54.33±13.15)个/视野、假手术组(24.33±8.62)个/视野、空白对照组(12.33±9.29)个/视野，与空白对照组比较，模型组、低浓度麝香酮组大鼠神经元细胞激活计数明显增多，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组大鼠比较，高浓度麝香酮组大鼠的星形胶质细胞计数显著增多，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。 结论: 1、脑缺血再灌注后大鼠脑组织自发地促进神经干细胞的增殖，可以诱导神经干细胞向缺血区皮质和纹状体迁移，从而分化为神经元（Neu-N标记的阳性细胞）和神经胶质细胞(GFAP标记的阳性细胞)，但数目较少。 2、经麝香酮灌胃治疗后，内源性NSCs增殖明显，并分化为神经元，而分化为星形胶质细胞数量较模型对照组少。 3、麝香酮能促进MCAO大鼠ENSCs的增殖，并且使神经干细胞向神经元分化增加，减少神经干细胞向星形胶质细胞的分化;高浓度麝香酮具有更强的促进NSC增殖分化的能力。
卒中;麝香酮;神经干细胞;实验药理
广州中医药大学
硕士
中医内科学
招远祺
2018
中文
R255.2;R285.5
2019-08-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）