龙胆苦苷与黄芩素对hiPS诱导的肝样细胞氧化损伤的保护作用
目的: 1.完善hiPSC诱导为肝样细胞的培养技术 2.建立hiPSC诱导而来的肝样细胞的氧化损伤模型 3.探讨中药单体龙胆苦苷及黄芩素对于hiPSC诱导而来的肝样细胞的氧化损伤模型的肝保护作用 方法: 1.hiPSC诱导分化为肝细胞:在分化前，将ips细胞培养于基质胶包被后的涂层培养瓶中，培养液为hiPSC培养液。开始诱导分化:使用细胞因子4步骤诱导分化方法:第1阶段8天，hiPSC分化为内胚层细胞的诱导，即在人iPSCs中加入100ng/mL激活素A(Activin A)、i0ng/mL骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic proteins-4.BMP-4)、20ng/mL成纤维生长因子-2(Fibroblast growth factor-2.FGF-2)、2％B27和1640细胞培养液;第2阶段5天，为内胚层细胞向类肝细胞的分化，即加入20ng/mL BMP-4、10ng/mL FGF-2、2％B27和1640细胞培养液;第3阶段5天，类肝细胞的扩增，即加入20ng/mL肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor.HGF)、2％B27和1640细胞培养液;第4阶段5天，类肝细胞的成熟，加入HCM和20ng/mL制瘤素M(Oncostatin M)。期间，用倒置荧光显微镜观察人iPSCs的诱导过程中第0、3，12，23天的细胞形态变化，观察人iPSCs诱导类肝细胞是否具有肝细胞的形态;用激光共聚焦技术检测iPSCs及肝细胞标志蛋白:GATA4、HNF-4α、AFP、ALB、P450的蛋白表达，以鉴定整个诱导过程。 2.肝样细胞氧化模型造模方法:使用LO-2细胞作为预实验以确定H2O2氧化损伤造模时的用量，将处于对数期生长的LO-2细胞消化后以7000个每孔接种于96孔板中，待24小时贴壁后分别加入用RPMI1640-FBS培养基稀释成10组不同浓度的H2O2工作液(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μmol/L)，以及0μmol/L的对照组，共计ii组，每组设4个复孔。在造模24h后，MTT检测其生存率以计算H2O2的IC50用量。将该用量加入诱导成功的肝样细胞中，检测对其细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)及丙二醛(MDA)的含量和细胞上清中谷丙氨酸转移酶ALT、及谷草氨酸转移酶(AST)水平的影响。 3.中药单体龙胆苦苷对于H2O2诱导的肝样细胞氧化损伤模型的肝保护作用研究 预实验使用LO-2以确定龙胆苦苷的有效作用范围。取已成功诱导的肝样细胞，加入300μmol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24h后，弃上清，加入4个浓度的龙胆苦苷溶液，其中设置对照组不造模不加龙胆苦苷，设置造模组不加龙胆苦苷，以检测氧化损伤造模24h龙胆苦苷的治疗作用。从肝保护相关生物标志物血清丙氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、及丙二醛(MDA)等变化考察龙胆苦苷对肝的保护作用机制。 4.中药单体黄芩素对于H2O2诱导的肝样细胞氧化损伤模型的肝保护作用研究 预实验使用LO-2以确定黄芩素的有效作用范围。取已成功诱导的肝样细胞，弃上清，加入不同剂量浓度的黄芩素溶液，加入黄芩素2h后，弃上清，加入300μmol/LH2O2制作氧化模型，其中设置对照组不造模不加黄芩素，设置造模组不加黄芩素。并于24h后收集细胞。实验重复三次，以检测黄芩素的预防作用。取已成功诱导的肝样细胞，加入300μmol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24h后，弃上清，加入4个浓度的龙胆苦苷溶液，其中设置对照组不造模不加龙胆苦苷，设置造模组不加龙胆苦苷，以检测黄芩素对于氧化损伤的肝样细胞模型的预防作用。并检测SOD、MDA、ALT、AST 结果: 1、人iPSCs诱导肝样细胞分化过程中的细胞形态变化:可见在开始诱导的第一天，细胞仍然保持iPS的形态，既成集落生长，细胞小且圆，密集生长，集团边缘明显。在第一阶段诱导结束的第八天，可见细胞集团边缘散开，细胞变大且不在呈圆形，而是类似椭圆形。在第二阶段诱导结束的第十三天，5倍镜下已完全无法看到细胞集落边缘，细胞完全散开，20倍镜下可见细胞间隙变大，细胞大小不一，细胞核小。在第三阶段诱导结束的第十八天，5倍镜下可见细胞变大，20倍镜下可见细胞形状同一，间隙变大且大小相似。在第四阶段诱导结束的第二十三天，5倍镜下可见细胞排列整齐，20倍镜下可见细胞大小形状基本一致且与正常人肝细胞的形态学特征相似，既呈多角形，核大且圆。 免疫细胞化学染色结果:在诱导过程的第8天，内胚层标记蛋白GATA表达。在诱导过程的第13天，标记蛋白HNF-4α表达，标志着细胞在向肝细胞分化谱系在体外的分化。在诱导过程的第18天，标记蛋白AFP表达，这是肝祖细胞的另一个重要指标，通常原始的肝细胞中表达。在诱导过程的第23天，标记蛋ALB、P450表达，这表明细胞具有分泌和解毒的功能。从结果看细胞的分化各个阶段的诱导过程准确无误，诱导的肝细胞已经成熟。在不同阶段的不同视野内统计标记蛋白及核蛋白的表达量可计算诱导成功率超过85％。 2.使用H2O2诱导LO-2细胞氧化损伤的剂量可以使用在肝样细胞氧化损伤造模中，并可以时肝样细胞表现出氧化损伤时表现出的多种酶系含量变化。 3.龙胆苦苷作用于H2O2诱导的肝样细胞氧化损伤模型的治疗时，可对于细胞内ALT，AST有不同程度的降低，其中ALT呈浓度依赖式降低，而AST对浓度的依赖并不明显。SOD有不同程度的升高，MDA有不同程度降低，对浓度的依赖同样不明显，说明龙胆苦苷对于iPSC诱导的肝样细胞氧化损伤模型有治疗作用。 4.黄芩素作用于预防H2O2诱导的肝样细胞氧化损伤模型时，对于细胞内的ALT，AST有不同程度的降低，且呈浓度依赖性，说明黄芩素对肝细胞膜结构的完整性保护的效果较好;SOD有不同程度的升高且呈现明显的浓度依赖性，MDA有不同程度降低，说明黄芩素可提高肝细胞对氧化自由基的清除率。说明黄芩素对于iPSC诱导的肝样细胞氧化损伤模型有预防作用。 结论: 1hiPSCs使用因子四步诱导分化方法可以将人诱导多能干细胞诱导分化成肝样细胞，成功分化的细胞具有肝细胞的形态可表达重要的肝细胞蛋白。 2.H2O2可作为肝样细胞的氧化损伤模型诱导剂。 3.龙胆苦苷及黄芩素对于H2O2诱导的肝样细胞氧化损伤模型有治疗及预防作用，其机制为清除氧化自由基，阻止细胞膜的破坏。
龙胆苦苷;黄芩素;肝样细胞氧化损伤;药理作用
广州中医药大学
硕士
中西医结合基础
曾星
2018
中文
R285
2019-08-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）