Conflin介导微囊泡生成在小鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用机制
本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 微囊泡与小鼠呼吸机相关性肺损伤的相关性 目的:探讨微囊泡(Microvesicles，MVs)与小鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)的关系。 方法:将36只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为自主呼吸组(A组)、正常潮气量(Vt)组(B组，Vt=7 mL/kg)、大Vt组(C组，Vt=20mL/kg)3组，每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下（氯胺酮:100 mg/kg）均经口直接气管插管，A组保持自主呼吸，B、C组进行各自Vt的机械通气（呼吸机参数:PEEP=0 cmH2O，RR=80次/分），并于4h后采用致死剂量麻醉药处死小鼠，立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。 各组小鼠BALF可进一步通过多步差速离心法进行MVs的提取:a.离心BALF以除去较大的颗粒(400 g，4℃，5min);弃去沉淀，离心上清液以除去细胞(2000 g，4℃，10 min);然后将上清液连续高速离心(50，000g，4℃，120 rmin)以沉淀微泡;将微囊泡沉淀经PBS洗涤后再以高速离心获取，重复两次以纯化MVs。 测定肺组织湿/干(W/D)质量比值，光镜下观察肺组织病理学改变，透射电镜下观察灌洗液MVs超微结构改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞，采用BCA法测定BALF中总蛋白水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平;蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）测定肺组织和MVs中Flotillin-2（微囊泡标志物）的表达，并检测MVs内NLRP3、COX IV、IL-1β和TNF-α的表达。 结果:光镜下观察显示，A、B组肺组织无明显病理学改变，C组可见肺泡腔破裂与融合，肺泡壁明显增厚，大量的炎性细胞聚集等明显的炎症性改变。C组肺W/D比值、 BALF中炎性细胞计数、总蛋白以及IL-1β和TNF-α水平均明显高于A、B组:[肺W/D比值:5.08±0.36比4.19±0.30、4.29±0.44;炎性细胞数(×104):112.4±21.3比26.4±8.6、33.4±11.6; BALF中总蛋白(g/L):1.157±0.161比0.482±0.193、0.544±0.215; BALF中IL-1β(pg/mL):130.25±28.58比74.88±20.32、84.25±11.96;TNF-α(pg/mL):517.700±40.72比404.31±31.84、421.62±48.04，均P＜0.05];C组肺组织中Flotillin-2蛋白的表达也均明显高于A、B组[Flotillin-2(R值):1.607±0.107比1.131±0.107、1.233±0.113，均P＜0.05]，而A组与B组上述指标差异均无统计学意义。透射电镜观察微囊泡MVs的超微结构，结果显示，MVs的形态呈圆形或椭圆形，且C组MVs的结构较A和B组均明显增大;相比于A、B组，C组MVs内高表达IL-1β和TNF-α[IL-1β(pg/mL):1225.29±26.38比974.50±51.52、1010.70±37.40; TNF-α(pg/mL):488.46±13.75比410.25±28.02、411.35±10.02，均P＜0.05];而三组MVs内无或低表达NLRP3和COX IV。 结论:机械通气所致的小鼠肺损伤可能与携带IL-1β和TNF-α的微囊泡密切相关 第二部分 微囊泡在小鼠呼吸机相关性肺损伤中的致炎作用 目的:观察MVs对小鼠肺组织中的炎性作用。 方法:多步差速离心法提取并纯化A、B和C组（part1）的MVs，其中C组最终离心步骤获得的上清液留作对照，以排除在MVs产生期间产生的可溶性因子的潜在影响。 将36只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法平均分为三组:对照组(Control)、实验组A(TestA)、实验组C(Test C)，每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下(氯胺酮:100 mg/kg)均经口直接气管插管，Control组小鼠接受C组沉淀MVs的上清液30μL滴注，Test A和Test C组小鼠则分别接受来自A组和C组的MVs悬液30μL。在小鼠自主呼吸4h后，采用致死剂量麻醉药处死小鼠，立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。 测定肺组织湿/干(W/D)质量比值，光镜下观察肺组织病理学改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞，采用BCA法测定BALF中总蛋白水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素-6(IL-6)水平。 结果:光镜下观察显示，相比于Control组，TestA、Test C两组小鼠肺组织可见散在分布的出血点，肺泡间隔明显增厚，炎性细胞大量聚集等明显的炎症性改变;而相比于TestA组，Test C组小鼠肺组织病理改变更明显。TestA、Test C两组小鼠肺W/D比值、BALF中炎性细胞计数、总蛋白和IL-6水平均明显高于Control组:[肺W/D比值:4.78±0.31、5.56±0.42比4.33±0.21;炎性细胞数(×104):75.3±37.9、142.6±62.4比20.4±8.9; BALF中总蛋白(g/L):0.396±0.039、0.531±0.090比0.257±0.044; BALF中IL-6（pg/mL）:10.1±1.1、14.5±2.9比5.8±1.2，均P＜0.05];此外，Test C组小鼠这些肺部炎症指标也明显高于TestA组。 结论:包裹IL-1β和TNF-α的微囊泡可增强肺部炎症反应。 第三部分 丝切蛋白在VILI小鼠微囊泡形成中的作用 目的:已知丝切蛋白(cofilin)在肌动蛋白动力学中起关键调节作用，且肌动蛋白丝可通过动态聚合和解聚而产生组织细胞的突起。因而，本研究探讨cofilin对VILI小鼠MVs形成的影响。 方法:将48只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法平均分为四组:对照组（Control组）、单纯抗体组（p-cofilin mAb组）、大Vt组(high-Vt组，Vt=20 mL/kg)、单纯抗体+大Vt组（p-cofilin mAb+high-Vt组），每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下(氯胺酮:100 mg/kg)均经口直接气管插管，Control、大Vt组和p-cofilin mAb、p-cofilin mAb+high-Vt组保持自主呼吸，经气管分别滴注30 tLPBS和p-cofilin mAb(1∶50)，1h后high-Vt组和p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠复合镇静、肌松（盐酸甲苯噻嗪，10 mg/kg）并进行Vt为20 mL/kg的机械通气（呼吸机参数:PEEP=0 cmH2O，RR=80次/分），并于4h后采用致死剂量麻醉药处死小鼠，立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。 测定肺组织湿/干(W/D)质量比值，光镜下观察肺组织病理学改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞，采用BCA法测定BALF中总蛋白水平;ELISA法测定血清和BALF中IL-6水平;Western Blot测定肺组织中p-cofilin、cofilin、Flotillin-2的表达。 结果:相比于Control和p-cofilin mAb组小鼠，high-Vt组小鼠肺组织内明显高表达p-cofilin、Flotillin-2;而相比于high-Vt组小鼠，p-cofilinmAb+high-Vt组小鼠肺组织内p-cofilin、Flotillin-2的表达明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05);表明当抗体阻断机械通气所致cofilin的磷酸化后，相应的由机械通气所致的MWs产生也明显减低。光镜下观察显示，与Control和p-cofilin mAb两组小鼠肺组织相比较，high-Vt、p-cofilinmAb+high-Vt两组小鼠肺泡腔有更多散在的出血点，肺泡间隔均明显增宽，有大量的炎性细胞浸润;而相较于high-Vt组，p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠肺部出血点减少、肺泡间隔和炎性细胞浸润也相对明显减低。同时，hi曲-Vt、p-cofilin mAb+high-Vt两组小鼠肺部炎症指标（肺W/D比、炎性细胞数、总蛋白和IL-6）均明显高于Control和p-cofilin mAb组小鼠，而p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠肺部炎症明显低于high-Vt组小鼠，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论:阻断cofilin的磷酸化可以抑制肺组织中MVs的形成，进而减少肺损伤。
呼吸机相关性肺损伤;病理机制;微囊泡;白介素-1β;肿瘤坏死因子-α;丝切蛋白
广西医科大学
硕士
麻醉学
潘灵辉
2019
中文
R563.02
2019-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）