西瓜中与CGMMV结构蛋白互作因子的筛选及sHSP功能分析
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，危害葫芦科作物，是我国重要的检疫对象。本研究构建了感CGMMV的西瓜茎叶组织的酵母双杂交cDNA文库，筛选了与CGMMV外壳蛋白(Coat Protein，CP)和复制相关蛋白的解旋酶结构域(Helicase，HEL)互作的寄主因子，以期为研究CGMMV与寄主因子互作机制奠定基础，为抗CGMMV育种提供新的思路。主要研究结果如下: (1)初步鉴定了6个与CGMMV CP和2个与复制相关蛋白的HEL结构域互作的寄主因子。首先成功建立了高质量的感CGMMV的西瓜茎叶组织的酵母双杂交cDNA文库。通过用CGMMVCP和复制相关蛋白HEL结构域作为诱饵筛选cDNA文库，并进一步在酵母中进行一对一互作验证，分别获得了6个与CP互作和2个与HEL结构域互作的寄主蛋白。与CP互作的寄主蛋白分别为:控制翻译的肿瘤蛋白、12-氧-植物二烯酸还原酶2、硫氧还蛋白h、膜锚定泛素折叠蛋白、真核翻译起始因子4B和4A-11;与HEL结构域互作的寄主蛋白分别为:小热激蛋白和蛋氨酸亚砜还原酶; (2)验证了sHSP与CGMMV复制相关蛋白HEL结构域的互作。克隆了与西瓜sHSP(ClsHSP)同源性最高、功能相似的本氏烟的sHSP(NbsHSP)基因，在酵母中分别验证了ClsHSP和NbsHSP与CGMMV的复制相关蛋白p129及其甲基转移酶(Methyltransferase，MT)结构域和间隔区域(Internal Region，IR)之间的互作情况，结果发现，ClsHSP和NbsHSP与CGMMV的p129及其HEL结构域存在相互作用，而与MT和IR不互作，说明ClsHSP和NbsHSP与复制相关蛋白HEL结构域存在特异性互作。为了避免酵母双杂交的假阳性，我们用GST Pull-down和免疫共沉淀方法对ClsHSP、NbsHSP与HEL结构域的互作进行了进一步验证，几种方法的验证结果一致，说明sHSP与CGMMV的HEL结构域确实存在相互作用; (3)明确了寄主sHSP的上调表达会抑制CGMMV RNA积累并延迟发病。qRT-PCR分析发现，CGMMV初侵染时会诱导寄主sHSP的显著上调表达，且与HEL互作的sHSP(Cla017945)上调表达最明显，而随着病毒在整个植物体内扩散，sHSP的表达趋于正常水平。进一步的亚细胞定位试验发现，在受CGMMV侵染的本氏烟表皮细胞中，sHSP本来在细胞质中形成的小颗粒消失而均匀分布于细胞质中。与CGMMV HEL共表达时，sHSP的分布与在感病细胞中的分布一致，说明CGMMV HEL通过与寄主sHSP互作改变了sHSP在细胞中的分布情况。为了进一步分析sHSP在CGMMV侵染中的作用，在沉默和超表达NbsHSP的转基因烟草植株上接种CGMMV发现，超表达NbsHSP的转基因烟草明显发病延迟并且其体内CGMMV RNA的积累量显著少于野生型植株。我们推测，sHSP可能是参与寄主响应CGMMV侵染的一个初级防御反应因子，CGMMV HEL通过与其互作而破坏了寄主的部分防御反应而促进了其侵染。该部分研究表明，与HEL互作的sHSP可能参与寄主的防御反应，sHSP是否可以作为以后抗CGMMV育种的新靶标有待进一步研究。
西瓜;黄瓜绿斑驳花叶病毒;解旋酶结构域;寄主因子;互作机制;sHSP基因;基因功能
中国农业科学院
博士
植物病理学
古勤生
2019
中文
S436.5
2019-08-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）