毛竹AQPs家族全基因组分析及PeTIP4；1-1和PePIP2；7功能研究
植物体内水分平衡调节是维持正常生命活动所必需的。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)通过调节细胞中水分快速流动，参与植物水分吸收、营养物质摄入和组织扩张等生理过程。植物的细胞分裂和细胞伸长离不开AQPs，依赖AQPs的细胞膨压为细胞的分裂和膨大提供动力，此外，持续的膨压可以诱使细胞壁的伸展，影响植物的生长。作为一类重要的森林植物，竹子能在短时间内完成高生长，其笋期的迅速生长是由细胞分裂和伸长共同决定的。研究表明，根压决定竹子的生长高度，水势是驱动毛竹快速生长的关键因素。因此，系统研究竹子AQPs(PeAQPs)基因的功能与水分平衡之间的关系，对于全面解析竹子的速生机制具有重要的科学意义。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为研究对象，从PeAQPs基因的全基因组鉴定出发，通过对PeAQPs的基因结构、编码氨基酸的基本理化性质、二级和三级结构等分析与预测，并在此基础上对毛竹快速生长期根压的日变化，不同组织的转录组数据，qPCR定量分析结果进行了综合分析，并对PeTIP4;1-1和PePIP2;7基因进行了功能研究。主要结果如下: 1.毛竹水通道蛋白基因的全基因组鉴定应用生物信息学方法对PeAQPs基因进行全基因组鉴定。以水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)的AQPs基因序列为诱饵，在毛竹基因组和转录组数据库中进行比对分析，删除保守结构域残缺序列，最终分别在第一版、第二版毛竹基因组数据库中鉴定到PeAQPs基因26个和63个。经过对PeAQPs基因结构、Scaffold位置，以及编码蛋白的基本理化性质、亚细胞位置、保守结构域和功能预测等的全面分析，明确了63个毛竹PeAQPs基因分别隶属于PIPs(22个)、TIPs(20个)、NIPs(17个)和SIPs（4个）四个亚家族，毛竹中不存在XIPs亚家族成员。 2.毛竹水通道蛋白基因表达模式分析应用转录组数据和qPCR技术对PeAQPs基因的表达模式进行分析。结果表明:在毛竹不同组织器官中、根和笋的不同生长时期，各PeAQPs的表达模式存在明显差异，如PePIP2;3和PePIP2;4主要在根中表达，PePIP2;7在叶片中特异表达;有9个PePIPs、5个PeTIPs和1个PeNIPs基因随着根的伸长表达量持续上升;5个PePIPs、8个PeTIPs和1个PeNIPs基因在笋的尖部随着笋的发育表达量持续上升。在干旱胁迫条件下，根和叶片中分别有3个和9个PeAQPs基因的表达量受到显著诱导;在NaCl胁迫条件下，根和叶片中分别有8个和2个PeAQPs受到显著诱导。各PeAQPs的表达模式呈现差异，表明其功能存在着一定的差异。 3.毛竹笋期根压与PeAQPs基因表达量关联分析毛竹笋期的根压测定结果表明，笋期具有强大的根压，如6 m高竹笋根压可达69.9 kPa。笋期根压呈现昼夜节律性变化，白天为负压，水分从笋中回流;夜间为正压，强大的根压将水分从竹笋基部运向顶部（吐水）。同时，发现一些在根压转变节点附近表达量较高的PeAQPs基因，如在根压转变节点(19时)时，PePIP1;4、PeTIP4;1和PeNIP3;3基因的表达丰度最高。此外，PeTIP4;2和PePIP2;8的基因表达量与根压呈现显著正相关。 4.毛竹PeTIP4;1-1基因功能鉴定通过RT-PCR技术成功克隆到根压转变节点表达量出现峰值的基因PeTIP4;1-1，其基因组序列长度为1777 bp，包含3个外显子和2个内含子，编码区全长为756 bp，编码251个氨基酸。PeTIP4;1-1编码蛋白具有6个跨膜结构域，同时具有控制水孔大小的两个NPA保守结构域。PeTIP4;1-1主要定位在液泡膜上，其基因在茎中表达量最高，且表达量随着笋的增高而逐渐上升。成功克隆到PeTIP4;1-1基因的上游启动子序列(1497 bp)，该序列包含大量胁迫应答元件，且能够诱导GUS基因在烟草(Nicotiana tabacum)叶片中表达。过量表达毛竹PeTIP4;1-1的转基因拟南芥在干旱和NaCl胁迫下抗性增强，表现为主根增长，Fv/Fm和NPQ值增加，SOD、POD和CAT酶活性提高，相对含水率提高，MDA积累量降低，同时内源胁迫相关基因AtNHX1、AtLEA和AtP5CS的表达量提高。由此表明，PePIP4;1-1基因通过表达调节水分平衡参与了竹笋的生长调控，并有助于增强毛竹抵抗干旱和盐胁迫的能力。 5.毛竹PePIP2;7基因功能鉴定成功克隆到一个叶片中特异表达的PIPs亚家族成员PePIP2;7基因，其基因组序列长度为1265 bp，包含4个外显子和3个内含子，编码区全长为864 bp，编码287个氨基酸。PePIP2;7编码蛋白具有6个跨膜结构域，同时具有两个NPA保守结构域。PePIP2;7主要定位在细胞质膜上，水分渗透胁迫因子干旱和NaCl处理后，随处理的时间延长PePIP2;7的表达量呈现先升高后降低的趋势。过量表达毛竹PePIP2;7可以提高转基因拟南芥在低温胁迫条件下光合能力，表现为Y(Ⅱ)和NPQ值的增加。由此表明，PePIP2;7基因通过调节叶片水分平衡响应外界胁迫环境。 本研究不仅为揭示水通道蛋白基因在毛竹中功能奠定了基础，而且为全面解析竹子快速生长的分子机制提供了参考依据，有助于今后竹子的分子育种。
毛竹;水通道蛋白基因;功能基因组;功能鉴定
中国林业科学研究院
博士
林木遗传育种
高志民
2018
中文
S795.7
127
2018-11-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）