基于RNA干扰的美国白蛾基因功能研究及转录组分析
美国白蛾是我国重要林业检疫性害虫，在我国东北、华北及华中部分地区暴发频繁，对我国森林健康和生态安全造成严重威胁。RNA干扰作为研究生物功能基因的重要分子生物学工具，已在多种昆虫中证明了利用该技术沉默重要发育基因，可显著影响昆虫的正常生长发育，是通过分子生物学手段控制害虫的潜在有力工具。RNA干扰在鳞翅目昆虫中较难实现，在美国白蛾中的利用也很少。本研究为进一步探索该技术在美国白蛾中的应用，选取了两种发育关键基因进行试验，并克隆和分析了系统性RNA干扰过程的关键基因SID-1，最后利用转录组测序技术分析了不同RNA干扰处理对美国白蛾幼虫基因表达的影响，并从其中找到与美国白蛾RNA干扰相关的基因。主要研究结果如下: (1)美国白蛾几丁质酶基因HcChi的RNA干扰研究为了解几丁质酶在美国白蛾幼虫蜕皮过程中的作用，利用实时荧光定量PCR检测了HcChi在美国白蛾四、五龄幼虫中的表达，结果表明龄期间该基因表达量维持在较低水平，蜕皮过程中HcChi的相对表达量与正常水平相比显著上调了13到17倍。不同dsChi剂量注射5龄幼虫，2.5μg可最高降低靶标基因表达量的66.8％，0.5μg最终导致幼虫化蛹率为31.03％，并在化蛹、羽化阶段产生畸形。不同注射时间均可下调4龄幼虫HcChi的表达，导致化蛹率显著下降至53.8％～77.8％，并在4龄到5龄蜕皮过程中产生畸形。构建了利用HT115菌株表达几丁质酶dsRNA的体系，分别从二龄和三龄起开始饲喂细菌表达的dsRNA，可分别导致幼虫体重显著降低40.7％和10.7％，但未产生畸形表型及化蛹率和死亡率的变化。表明与直接注射相比，饲喂细菌表达的dsRNA对幼虫生长的影响较小，但具有一定的累积效应。 (2)美国白蛾两个乙酰胆碱酯酶基因HcAce的克隆及RNA干扰研究乙酰胆碱酯酶是生物中神经系统的关键酶，是有机磷等农药的靶标。本研究通过RT-PCR从美国白蛾幼虫中克隆得到两个乙酰胆碱酯酶基因cDNA全长，并进行序列分析。获得HcAce1基因编码区长度2085 bp，预测编码694个氨基酸，HcAce2基因编码区长度1917bp，预测编码638个氨基酸。两个HcAce均具有典型的乙酰胆碱酯酶的特征，系统进化分析表明了乙酰胆碱酯酶在昆虫中进化的保守性。RNA干扰试验表明，沉默HcAce1和HcAce2，其相对表达量分别降低22.1％和66.6％，AChE酶活分别显著下降43.3％和76.2％，10天后幼虫体重比对照显著下降25.4％和31.9％，沉默HcAce1还导致幼虫89.7％的死亡率，可认为ACHE1在美国白蛾AChE中占主导地位。本研究还构建了利用大肠杆菌HT115菌株表达HcAce1和HcAce2 dsRNA的体系，为后续的饲喂试验提供基础。 (3)美国白蛾SID-1基因的克隆及功能验证通过RT-PCR和RACE技术在美国白蛾幼虫中克隆得到一个在系统性RNA干扰过程中负责dsRNA转运的关键基因SID-1 cDNA全长。该基因开放阅读框长度2613 bp，编码870个氨基酸，预测该基因具有长的胞外N末端、11个跨膜结构域等典型的SID蛋白结构域，系统进化分析显示了该基因与其他SID基因的同源性。时空表达模式分析，该基因在美国白蛾发育各时期各组织中均有表达，在幼虫中肠中的表达量最高。RNA干扰可显著下调HcSID-1基因表达量的46.5％，且该基因的下调可显著降低dsChi的干扰效率，最高可达7.32倍，表明HcSID-1可能参与了美国白蛾中系统性RNA干扰的过程。 (4)美国白蛾不同RNA干扰处理后的转录组测序分析本研究设置自然生长、注射ddH2O、注射dsGFP、注射dsSID-1、注射dsChi、注射dsSID-1+dsChi等六个RNA干扰处理，对处理后12h的美国白蛾幼虫进行转录组测序分析。共获得132.55 Gb Clean Data，每个样品平均6.69 Gb，组装后共得到103647条Unigene，平均长度为699.99 bp，数据库比对后得到18051个有注释信息的Unigene，占总数的17.4％。不同RNA干扰处理间差异表达基因分析后，获得大量差异表达基因DEG。通过KEGG分析，发现几丁质酶参与氨基糖与核苷酸糖代谢通路，且该通路中有多个受RNA干扰影响的基因。对unigene搜索后，获得29个与RNA干扰机制相关的基因，包括Dicer、Argonaute等核心元件、RISC复合体组分及与dsRNA转运相关基因。KEGG分析表明这些基因参与多个生理通路，RNA干扰处理可调控通路中多个基因的表达。 利用RNA干扰等分子生物学方法控制害虫是生态防治的新策略。本研究通过RNA干扰技术，探索两个重要生长发育基因沉默对美国白蛾的影响，并克隆得到dsRNA转运的关键基因，为RNA干扰在美国白蛾中的应用提供基础。利用转录组测序技术研究了RNA干扰处理后美国白蛾中相关关键基因的调控，得到与靶标基因相关的通路基因及参与RNA干扰机制的重要基因，为深入研究美国白蛾的RNA干扰机制和利用RNA干扰控制美国白蛾提供理论及数据支持。
美国白蛾;RNA干扰;几丁质酶;乙酰胆碱酯酶;转录组测序
中国林业科学研究院
博士
昆虫生态学
张真
2018
中文
S763.42
138
2018-11-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）