蛋白类重要生物标志物的分离纯化和定量技术的研究
基体标准物质相对于纯品标准物质，更接近于待测物质的真实情况，用于定量时测量结果更精确。本实验研究血清中生物标志物的提纯和定量，基于免疫磁珠富集工艺，实现了血清中低丰度生物标志物的分离和纯化，建立了准确定量目标物的方法，为血清基体标准物质研制提供参考。 由于血清基体中蛋白质种类繁多，为了避免基质效应，实现对于特定低丰度蛋白的分离纯化，使其达到定量方法的检测限，需要对目标物特异性提纯。本研究采用免疫磁珠富集工艺，通过结合单克隆抗体的磁珠将血清中目标蛋白提纯，实现目标蛋白质的富集。将提纯后的蛋白质经过酶切过程分解为特征肽段，通过对特征肽段定量实现血清中蛋白质定量的目的。 为了准确测定作为定量特征肽段基准的合成肽段纯度，本研究以合成胰高血糖素为例，建立了质量平衡法测定固相合成肽段纯度的定量方法。分别对目标物中杂质准确定量，总质量扣除杂质质量得到样品纯度为89.64％。该结果相比于常用的高效液相法(98.37％)精确度更高。 将方法用于血清中小分子多肽的分离纯化和定量，本研究选用糖尿病生物标志物C肽为例。通过免疫磁珠富集技术，实现血清中C肽的分离和提纯，建立了同位素稀释质谱法对血清中C肽的定量方法。通过添加同位素标记C肽为参考，优化免疫磁珠富集过程，得到免疫磁珠富集效率为80.22％。采用同位素稀释质谱法对血清中分离纯化后的C肽进行定量，得到其浓度为10.80ng/mL。 通过对免疫磁珠富集工艺中磁珠与抗体的结合效率、抗体与蛋白的结合效率、抗体的负载量、洗脱时间因素的优化，设计了结合单克隆抗体的聚苯乙烯磁珠分离纯化血清中C反应蛋白的工艺。采用胰蛋白酶方法对C反应蛋白进行酶切，通过添加超滤技术提高蛋白的酶切效率，使得肽图覆盖率提高至86.16％，同时得到其特征肽段为ESDTSYVSLK(EK)。通过对合成特征肽段EK的质谱定量，得到样品血清中C反应蛋白酶切后EK浓度为0.10ug/mL，依据特征肽段和C反应蛋白物质的量关系，计算得到样品血清中C反应蛋白的含量为2.06ug/mL。 本实验建立的血清中蛋白类生物标志物的分离纯化和定量方法，为血清基体标准物质的研制提供参考。
蛋白类重要生物标志物;分离纯化工艺;定量技术;免疫磁珠富集法
北京化工大学
硕士
化学工程
孙巍;宋德伟
2018
中文
R446.1
117
2018-09-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）