中间产物转运调节及辅底物再生提高戊二酸产量
戊二酸是尼龙-4，5和尼龙-5，5等聚合物的重要的C5二羧酸结构单元，在药物和化工合成领域具有重要的应用价值。通过传统化学法合成戊二酸成本高、污染严重，因此利用生物法合成戊二酸对于合成高分子聚合物具有十分重要的意义。 本论文利用合成生物学的技术与策略，设计了一条全部由内源酶组成的生物合成戊二酸的途径。对途径中的关键酶进行体外活性筛选分析，结果显示:patA能有效催化戊二胺转氨，体外条件下最适pH为8.5，转化速率可达10mM·h-1;patD能有效催化5-氨基戊酸转氨，初速度可达1.67mM·h-1。 通过在宿主大肠杆菌中构建途径进行体内转化实验，实现了戊二酸的积累。针对最初菌株产量不稳定的现象，本研究将代谢路径分为cadA、patAD、gabTD三个模块。通过将三个模块基因分别与pZE12-luc，pCS27，pSA74三种不同拷贝数的质粒连接进行了模块化优化。结果显示，pSA-cadA及pCS-patAD-gabTD为模块最佳组合，初步摇瓶试验中戊二酸产量达到了1.36g·L-1。 模块优化过程中发现，中间产物5AVA及戊二胺由于转运受阻而在发酵液中大量积累。为了解决5AVA转运的问题，本研究首次尝试过表达4-氨基丁酸的转运蛋白(gabP)。结果显示gabP也能有效转运5AVA，发酵液中不再积累5AVA，戊二酸产量达到2.34g·L-1，提高了72.06％。类似的，本研究尝试敲除cadB，sapB，potE或过表达potE，puuP以减少戊二胺的积累，但是并没有取得理想的效果。原因可能是戊二胺与产物戊二酸中和更有利于细胞生长。本研究还通过敲除谷氨酸脱氢酶(gdhA)实现了辅底物α-酮戊二酸的循环再生，使戊二酸的产量进一步提高到2.57g·L-1。最后，通过在培养基中添加适量的辅底物，使目标产物产量达到3.09g·L-1。
戊二酸;生物合成;参数优化;中间产物;转运速率;辅底物再生
北京化工大学
硕士
药学
袁其朋
2018
中文
TQ225.145
85
2018-09-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）