谷氨酰胺转氨酶的分离纯化及其在豆腐生产加工中的应用
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，TGase)是一种能催化酰基转移反应的转移酶，可催化蛋白质在分子内和分子间发生共价交联，改变蛋白质的结构，影响蛋白质的性质如:发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观，因此其在食品工业中有广泛的应用前景。 豆腐是最常见的豆制品，富含蛋白质、维生素、矿物质和微量元素。其因凝固剂的不同主要分为三类:一是以盐卤为凝固剂，多见于北方地区，称为北豆腐，含水量在85％～88％，较硬;二是以石膏粉为凝固剂，多见于南方，称为南豆腐，含水量较北豆腐多，可达90％;三是以葡萄糖酸内酯为凝固剂，称为内酯豆腐。与其他传统豆腐制作工艺相比，内酯豆腐有较高的出品率和产品质量，较少的环境污染等优点，但也有强度不足、缺少豆香味的缺点。本试验在内酯豆腐制作工艺的基础上，探索TGase与葡萄糖酸内酯共同作用对豆腐品质的影响，以建立豆腐生产新工艺，提高产品产量和质量，满足消费者需求。 本试验通过对市场常见五种TGase酶制剂产品酶活性的检测，选择质量最佳的酶制剂产品进行TGase的分离纯化、研究其酶学性质并对其在豆腐生产加工中的应用进行了探讨。主要研究内容如下: (1)将市场上常见的TGase酶制剂等量稀释后进行了酶活性和酶的比活力检测，通过酶活性确定酶产品的质量，其中质量最佳的样品酶制剂为产品“D”，其酶活性浓度为0.466U/mL，比活力为29.36U/mg。 (2)以产品“D”为研究材料，通过分子筛法和离子交换层析法对其TGase进行了分离纯化。Native-PAGE和SDS-PAGE电泳结果证明具有TGase活性的目的蛋白分子量约为80kDa;产品“D”通过SephadexG-100分离纯化后，具有TGase活性的蛋白组分酶活性浓度为0.592U/mL，蛋白浓度为9.22μg/mL，比活力64.21U/mg，与初始样品比较，TGase被纯化了2.119倍;回收蛋白组分经DEAE-52阴离子交换层析分离纯化后，TGase组分的酶活性浓度为0.521U/mL，蛋白质含量6.613μg/mL，比活力为78.78U/mg，TGase被纯化了2.638倍;SDS-PAGE电泳确定纯化后的TGase由分子量约为80kDa的两条蛋白带组成。 (3)研究了温度、pH、有机溶剂、金属离子、贮藏温度对TGase活性的影响以及不同条件相互作用时各个因素对体系反应进程的影响。结果表明纯化后的TGase最适反应温度为55℃，最适pH为6～7;K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-离子对TGase活性均无影响，但Cu2+对TGase活性具有明显抑制作用;乙醇对TGase活性有抑制作用，当乙醇浓度达到40％时，对TGase活性抑制作用最强。TGase在-20℃～65℃下保存48小时后发现，55℃以下保存对酶活没有明显影响，60℃以上对酶活有抑制作用。在一定条件下，影响体系反应速率的最主要因素为体系的pH，其次为体系内乙醇的比例，第三为反应时间，最后为反应体系的温度。 (4)研究了不同添加量的TGase与葡萄糖酸内酯组成的复合凝固剂对豆腐品质的影响。将通过感观评价和二次咀嚼测试确定最适宜的添加比例。利用感官评定的方法，分别评价了TGase含量2.5％、5％、7.5％;内酯含量0.1％、0.2％，0.3％以及二者交叉组合添加的试验成品，评价结果表明:TGase添加量为5％，葡萄糖酸内酯添加量为0.2％最受欢迎。 (5)为进一步优化豆腐凝固剂配比，利用响应面设计方法确定了豆腐的复合凝固剂中各成分的比例。以TGase(A)、葡萄糖酸内酯(B)点浆温度(C)为自变量，分别以弹性(R1)、内聚性(R2)为响应值，通过Design Expert软件对试验数据进行二次多项式回归分析，确定出适宜的加工条件为:TGase添加量4.82％、内酯添加量0.17％、点浆温度为52.56℃，此时的弹性3.62772mm，得到如下回归模型:R1=3.60-0.047A+0.011B+0.086C-0.073AB-0.027AC-0.085BC-0.15A2-0.12B2-0.076C2结果表明:在此条件下进行豆腐的制作，此时的弹性3.62772mm，弹性程度符合消费者需求。若以内聚性(R2)为响应值，通过Design Expert软件对试验数据进行二次多项式回归分析，得到回归模型:R2=0.27-1.25E-4A-2.00E-3B+2.625E-3C-1.5E-3AB-2.5E-4AC-1.500E-3BC-1.875E-3A2-2.625E-3B2-3.875E-3C2结果表明:此条件下，内聚性为0.266893Ratio，产品质地良好，达到了预期效果。 结合感官评定与响应面分析，最终确定TGase添加量为4.8％，内酯添加量0.17％，为复合凝固剂使用时的最优组合比例，而最优的点浆温度为52℃。将试验成品与市场常见豆腐同时进行质构测定及感官分析发现，添加了TGase的豆腐在组织状态和滋气味方面均有优势，因此其在豆腐生产加工方面具有广泛的应用前景。
豆腐;复合凝固剂;谷氨酰胺转氨酶;分离纯化工艺;葡萄糖酸内酯;配合比
河北农业大学
硕士
食品加工与安全
檀建新
2017
中文
TS214.2
64
2018-06-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）