灰葡萄孢BcKMO基因与信号途径关键基因的关系研究
实验室前期通过筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库，获得了1株不产生菌核的突变体BCG183，明确了其突变基因为BcKMO，该基因编码犬尿氨酸单加氧酶（kynurenine3-monooxygenase，KMO）。通过构建BcKMO基因的回复突变体BCG183/BcKMO，明确了BcKMO基因正调控病菌的生长、发育，负调控病菌的致病力;确定了BcKMO基因通过影响病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因及信号途径基因的表达来调控病菌的致病力。本研究利用外源蛋白重组表达技术获得了纯化的BcKMO蛋白，并确定了其具有犬尿氨酸单加氧酶活性;通过检测BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的表达规律，分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系;通过检测BcKMO基因突变对cAMP、MAPK途径关键基因表达的影响，以及cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响，进一步分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系。主要研究结果如下: 1.利用外源蛋白重组表达技术，获得了纯化的BcKMO蛋白;利用酶联免疫分析技术，确定了纯化的BcKMO蛋白具有犬尿氨酸单加氧酶活性，其酶活力为2.56U/L。 2.利用Real-time PCR技术，检测病菌不同发育阶段、不同组织部位及不同培养条件下BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因的表达水平。结果发现，BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3的表达规律基本一致，均是在7d的菌丝和菌核中表达水平较高;BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因均是在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高;在不同培养条件培养的病菌中，BcKMO基因的表达规律与bmp1基因基本一致。推测，BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1、bmp3间的关系较为密切。 3.利用Real-time PCR技术，对BC22、BCG183和BCG183/BcKMO菌株中BcKMO基因、cAMP关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因（bmp1、bmp3）的表达水平进行检测。结果发现，在BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达水平均明显高于野生型和回复突变体，MAPK途径关键基因bmp3的表达水平明显低于野生型和回复突变体，表明，BcKMO基因负调控cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达，正调控MAPK途径关键基因bmp3的表达。 4.利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，获得了cAMP途径关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因（bmp1、bmp3）的RNAi突变体。采用Real-time PCR技术，检测各基因RNAi突变体中BcKMO基因的表达水平。结果发现，cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显高于野生型，而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显低于野生型，表明cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1负调控BcKMO基因的表达，而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3正调控BcKMO基因的表达。
灰葡萄孢;BcKMO基因;信号途径关键基因;功能鉴定;外源蛋白重组
河北农业大学
硕士
生物化学与分子生物学
邢继红;董金皋
2017
中文
Q949.328.406
75
2018-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）