玉米大斑病菌StLAC4、StLAC6漆酶基因表达和功能分析
漆酶是一种多铜氧化酶，不仅在真菌的生活史中发挥重要作用，同时在真菌黑色素代谢、致病性以及工业应用中具有较高的研究价值。为明确漆酶同工酶基因在玉米大斑病菌中的生物学作用，本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了该病菌在不同木质素分解产物存在下不同漆酶基因的表达规律;通过生物信息学技术分析病菌中归类为典型子囊菌漆酶StLAC4和StLAC6基因结构并对其进行异源表达，分别纯化得到了其纯品重组漆酶Stlac4和Stlac6，经检测，Stlac4和Stlac6均具有漆酶活性;根据同源重组的原理构建了StLAC4和StLAC6基因敲除载体，利用原生质体转化获得了StLAC4基因缺失突变体，并初步分析其在病菌中的作用。研究结果为进一步明确漆酶同工酶基因StLAC4和StLAC6在玉米大斑病菌致病过程中的作用奠定了基础。主要研究结果如下: 1.利用实时荧光定量PCR技术分析了玉米大斑病菌2个漆酶基因在木质素分解产物存在下的表达情况，结果显示，在加入香草酸时StLAC4和StLAC6的相对表达量显著升高，其中StLAC4的相对表达量为对照的4.9±1.4倍;当添加4-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲醛时，StLAC4的相对表达量显著升高，分别为CK的4.6±0.9倍和3.1±0.5倍。 2.利用生物信息学技术分析发现Stlac4和Stlac6具有漆酶典型的三个多铜氧化酶铜离子结合位点及催化结构域;预测Stlac4和Stlac6蛋白分子量分别为65.94kDa和65.86kDa，等电点为7.16和5.07，总体疏水性(GRAVY)为-0.350和-0.296，表明其为亲水蛋白。 3.构建了pET-Stlac4和pET-Stlac6两个蛋白表达载体，并以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行了成功表达，采用His标签纯化得到Stlac4和Stlac6两个漆酶蛋白。利用纯化蛋白体外催化漆酶典型底物ABTS，测得Stlac4和Stlac6最适反应温度均为60℃，最适反应pH均为4.0;同时检测Li+、Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Fe3+和Cu2+及SDS对重组漆酶酶活的影响，发现在Fe3+和Cu2+存在下Stlac4和Stlac6酶活明显升高，而在高浓度抑制剂SDS存在时，两个漆酶活性均受到明显抑制。 4.以质粒pBS为骨架，分别以草铵膦和潮霉素为抗性基因，按同源重组的原理成功构建了StLAC4和StLAC6两个基因的敲除载体，原生质体转化获得了StLAC4的基因缺失突变体，初步分析发现StLAC4基因的缺失导致突变菌株不能产生分生孢子，生长速率略有变慢，菌落颜色变浅，菌丝疏水性降低，并在一定程度上对细胞壁完整性有所影响。
玉米;大斑病菌;漆酶;StLAC4基因;StLAC6基因;分生孢子;致病性
河北农业大学
硕士
植物学
曹志艳;董金皋
2017
中文
S435.131
85
2018-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）