利用转录组学技术对保加利亚乳杆菌ATCC11842后酸化分子机制的研究
酸奶是含有活菌的乳制品，在正常的发酵结束后，菌体仍会利用其中的营养物质进行新陈代谢，同时会继续产酸，即发生后酸化。后酸化导致酸奶的口感下降、货架期缩短，严重影响乳制品行业的发展。研究表明，保加利亚亚种是导致酸奶后酸化的直接原因，在酸奶发酵后期控制保加利亚乳杆菌的生长代谢是解决后酸化的关键。近年来，国内外学者展开了对后酸化机理的研究并取得了一定的成果，但研究主要集中在H+-ATP酶和β-半乳糖苷酶，而关于后酸化调控模型的研究未见报道。后酸化导致菌体生长处于酸和冷胁迫，因此本研究采用转录组学技术结合荧光定量PCR技术对模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC11842菌株在酸胁迫和冷胁迫的过程中参与后酸化的关键基因进行分离鉴定，为全面揭示乳酸菌的酸耐受机制奠定理论基础，同时为工业生产中解决酸奶后酸化问题提供理论依据。 研究内容及结果如下: (1)不同处理下保加利亚乳杆菌ATCC11842转录组测序及测序质量评估 对保加利亚乳杆菌(ATCC11842)进行酸胁迫及酸和冷的胁迫处理，样品分别命名为T1和T2，对照未胁迫处理样品命名为CK。分别提取各样品RNA，逆转录，构建测序文库。利用Illumina HiSeq2000测序平台进行转录组测序。转录组测序得到的原始数据(reads)信息已经提交到NCBI的SAR数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra_sub/sub.cgi)，CK（编号为:SRR3490433），T1(编号为:SRR3490716)，T2(编号为:SRR3501037)。 (2)保加利亚乳杆菌胁迫过程qPCR内参基因的筛选及转录组测序结果的验证 通过对保加利亚乳杆菌ATCC11842在空白处理(CK)、酸胁迫(T1)、酸和冷胁迫(T2)三种试验条件下的5个候选内参基因(16s-rDNA、rpoB、ldh、rodA和recA)的表达稳定性进行了研究，通过三种常用的程序geNorm、NormFinder和Bestkeeper筛选出合适的内参基因用于后续试验荧光定量PCR数据的校正，最终确定rpoB基因和recA基因为本试验理想的内参基因，并用筛选得到的内参基因对随机选取的9个基因的转录组测序结果进行了qRT-PCR验证，结果显示9个基因的表达量变化趋势与测序结果一致，表明了转录组测序数据的可靠性及选取的内参基因的稳定性。 (3)保加利亚乳杆菌ATCC11842后酸化相关基因的转录水平的分析 经过生物信息学分析，发现在样品CK共有1503个基因参与表达，T1中共有1506个基因参与表达。通过比较CK与T1之间表达谱的差异发现所有参与酸胁迫过程的基因。经过差异分析，269个基因在酸胁迫（样品T1）过程中上调，143个基因酸胁迫后下调，表明412个基因与酸胁迫过程有关。转录组测序结果显示，T2中共有1504个基因参与表达过程，与空白处理(CK)转录组数据对比，在T2样品中存在69个上调基因和33个下调基因。同时我们对412个酸响应基因在冷胁迫下的基因表达量变化进行了统计分析，参照转录组测序结果，酸响应基因在冷胁迫下主要有以下几种变化趋势: a.冷胁迫处理后酸响应基因的变化趋势与酸胁迫处理下基本一致。 b.冷胁迫处理后酸响应基因变为非差异基因。 c.冷胁迫处理后酸响应基因表达量下调。 统计数据显示，269个上调表达的酸响应基因，冷胁迫处理后，57个基因的表达量变化趋势基本一致，说明冷胁迫并未影响这些酸响应基因的表达;207个上调酸响应基因在经过冷胁迫后，表达量差异不显著，说明冷胁迫使这些基因退出酸响应过程;而其中的5个基因在冷胁迫后，表达量显著下调，表明冷胁迫严重抑制了这些酸响应基因的表达。同样，酸胁迫下表达量下调的143个基因中，冷胁迫处理后，17个基因的表达量变化趋势基本一致，说明冷胁迫并未影响这些酸响应基因的表达，126个下调酸响应基因在经过冷胁迫后，表达量差异不显著，说明冷胁迫使这些基因退出酸响应过程。进一步我们认为上调表达的57个和下调表达的17个酸响应基因在受冷胁迫处理后仍然参与酸响应过程，正如酸奶发酵结束低温贮存过程一样，这些基因是参与酸奶后酸化过程的基因。 同时对筛选到酸响应基因和参与到后酸化过程中的关键基因进行GO分析，GO功能富集性分析表明保加利亚乳杆菌ATCC11842差异表达的基因主要集中在以下功能类群:biological process，cellular component和molecular function。通过KEGG数据库对差异显著基因的pathway富集分析，找到了参与到后酸化的关键基因。
酸奶;保加利亚乳杆菌;后酸化机制;酸响应基因;转录组学
河北农业大学
硕士
发酵工程
田洪涛;李晨
2017
中文
TS252.54
70
2018-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）