黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及RDV感染对其转录水平的影响
黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps(Uhler)属于半翅目叶蝉科，是我国水稻上重要害虫之一。黑尾叶蝉除刺吸取食水稻汁液为害外，还能传播水稻矮缩病毒(rice dwarf virus, RDV)，对水稻造成了严重危害。昆虫先天免疫是昆虫防御病原微生物的首道防线，而肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)则是昆虫免疫系统中的重要免疫识别蛋白，在昆虫产生抗菌肽等免疫物质的过程中起到重要调控作用。黑尾叶蝉作为RDV的介体昆虫，目前关于RDV对黑尾叶蝉免疫能力影响的相关报道较少。本文通过转录组分析，得到数个黑尾叶蝉PGRPs基因，筛选出其中转录水平被RDV所抑制的PGRPs，通过基因克隆及原核表达研究NcPGRP分子特性和蛋白特性，利用定量PCR和RNAi技术研究NcPGRP在黑尾叶蝉免疫反应中的功能。主要研究内容如下: 1.以各常见昆虫PGRP基因作为参考序列，通过本地blast从黑尾叶蝉转录组数据中筛选到12个E值(E-Value)较高的PGRPs基因。利用定量PCR检测感染RDV黑尾叶蝉体内各PGRPs的表达量，筛选出3个转录水平会受到RDV抑制的PGRPs基因。 2.NcPGRP基因克隆结果显示，NcPGRP基因开放阅读框大小为552 bp，预测蛋白大小约19.9 kDa，等电点(pI)为7.29，N端无信号肽，15～34位氨基酸为跨膜结构域，含3个锌离子结合/酰胺酶催化位点，1个二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚糖识别位点。系统发育分析表明，NcPGRP与其他昆虫亲缘关系较远。组织分布研究表明，NcPGRP基因的mRNA在各组织中均有表达，且头部表达量最高。 3.利用黑尾叶蝉NcPGRP基因序列构建重组表达载体，并在大肠杆菌Rosetta菌株中进行诱导表达。结果显示NcPGRP蛋白大小约20 kDa。利用其氨基酸序列制作多肽抗体。Western blot检测结果表明黑尾叶蝉体内NcPGRP蛋白的表达量很低。 4.利用显微注射技术对黑尾叶蝉进行病原细菌感染，定量PCR结果显示，NcPGRP的转录水平在大肠杆菌Escherichia coli DH5。及藤黄微球菌Micrococcus luteus感染叶蝉后显著上调，且两种病原细菌上调NcPGRP转录水平的能力没有显著差异。成虫羽化后NcPGRP转录水平逐渐上升，在羽化后第10天达到峰值，后开始逐渐下降。黑尾叶蝉在取食感染水稻普通矮缩病毒RDV的水稻后，NcPGRP转录水平受抑制。使用dsPGRP对黑尾叶蝉进行RNA干扰，当注射剂量为10 ng时，NcPGRP的沉默效果最为显著，且持续时间最长，然后分别用两种病原菌对RNA干扰后的虫体进行感染。结果显示，与对照相比，大肠杆菌E.coliDH5α和藤黄微球菌M.luteus均没有显著提高黑尾叶蝉的死亡率，并且两种病原细菌对黑尾叶蝉的致死能力也没有显著差异。
黑尾叶蝉;PGRPs基因;基因克隆;定量PCR;RNAi技术;免疫反应
中国农业科学院
硕士
植物保护
林克剑
2017
中文
S433.3
74
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）